[보고서]식물 저온저항성 및 기관발달 유전자 기능 규명과 형질전환체 개발

박충모

보고서 정보

주관연구기관

서울대학교
Seoul National University

연구책임자

박충모

참여연구자

류재용 , 이상민 , 윤주 , 정은영 , 박미정 , 이재형 , 그외 다수

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2015-02

과제시작연도

2014

주관부처

농촌진흥청

사업 관리 기관

농촌진흥청
Rural Development Administration

등록번호

TRKO201500010197

과제고유번호

1395035356

DB 구축일자

2015-07-11

표 년도 별 국내 오이 생산량(2005년 채소생산실적
표 도관세포 분화의 세포사멸 과정에 대한 모식도
표 도관세포 분화를 조절하는 RabG3b와 자식작용 기능에 대한 모델
표 2차 세포벽 합성의 전사조절 네트워크 모식도
표 오이 형질전환을 위해 사용된 형질전환의 모식도
표 오이 형질전환 식물체의 제작 과정
표 NIT 유전자 도입 확인을 위한 PCR 분석 결과
표 CrtW 유전자 도입 확인을 위한 PCR 분석 (A) 및 Southern 분석 (B)결과
표 Nit 유전자의 발현 분석을 위한 RT-PCR (B) 및 Northern 분석(C) 결과
표 형질전환체의 저온스트레스에 따른 광합성 효율 분석. A, T1 식물체; B, T2 식물체
표 형질전환체 잎절편에 저온스트레스 처리 후 이온누출량 분석.A, T1 식물체; B, T2 식물체
표 형질전환체 잎절편에 염스트레스 처리 후 이온 누출량 분석.
표 2-D SDS-PAGE 상에서 저온처리 시간 및 계통간 차이를 나타내는 단백질 spot
표 CsPti1 유전자의 오이 조직 특이적 발현양상
표 흰가루병균 접종에 의해 CsPti1유전자의 발현양상
표 병 방어반응관련 식물 호르몬 처리시에 CsPti1유전자의 발현양상. (A) Methyl jasmonic acid, (B) Salicylic acid를 오이 잎에 spray처리한 후 발현 양상 분석 (C) NaCl은 잎을 200 mM 용액에 deeping 처리한 후 시간대별로 조사
표 CsPti1유전자를 과발현시킨 담배에 200 mM NaCl를 처리한 후 염 내성 조사. 형질전환체 lines #7, 8, 9, 11, 15 총 5 lines을 조사한 결과 강한 내성을 보이는 것으로 확인됨
표 오이 LOX 유전자의 연관 분석 결과
표 저온처리에 따른 lipoygenase의 발현 변화
표 23개 CsLOX 유전자의 RT-PCR에 의한 발현 양상 분석 흰가루병원균 처리, 1 mM SA, 100 μM MeJA, 100 μM SA
표 생물학적/비생물학적 스트레스 조건에서 23개 CsLOX 유전자의 상대적 발현 양상
표 Schematic representation of low complexity and repetitive masking process applied for preprocessing of carrot root transcriptome.
표 Definition of RPKM
표 List of primer sets used in real time qPCR.
표 Construction and identification of PSRD1-SRD1 binary vector.
표 Carrot transformation and regeneration of transformed calli.
표 Carrot transformation and regeneration of transformed calli.
표 Genomic DNA isolation from putative transgenic carrot plants transformed with PSRD1-SRD1 or pBI101 binary vector. Genomic DNAs were extracted from leaf tissue cultured in vitro.
표 Identification of transgenic carrot plants using PCR amplification. PCR amplification was conducted with genomic DNAs extracted from the putative transgenic carrot plants designated in each lane using nptII-specific primers. Arrow indicates the expected size of PCR product amplified from nptII gene. PC, positive control amplified from nptII plasmid DNA.
표 Identification of insertion of SRD1 cDNA in the putative transgenic carrot plants. PCR amplification was conducted with genomic DNAs extracted from the putative transgenic carrot plants designated in each lane using SRD1-specific primers. Arrow indicates the expected size of PCR product amplified from SRD1 cDNA. PC, positive control amplified from SRD1 plasmid DNA. WT, negative control amplified from wild-type carrot genomic DNA.
표 Transcript level of SRD1 in PSRD1-SRD1 transgenic carrot plants. Total RNA was extracted from taproot tissues of the transgenic carrot plants cultured in vitro for three months. PCR amplification was performed using SRD1-specific primers and expression levels were normalized with EF1-α expression amplified with EF1-α-specific primers in the RT-PCR. Error bars indicate the standard deviation (SD) between three technical replicates measured on taproots collected from at least three different transgenic carrot plants and subsequently pooled for analysis.
표 Taproot development in SRD1-transgenic carrot plants. SRD1 transgenic carrot plants were cultured in vitro for 3 months and taproot development was compared between SRD1-transgenic and control (transformed with pBI101 vector) plants.
표 Thickening growth of taproots in SRD1-transgenic carrot plants. Root diameter was compared between SRD1-transgenic and control (transformed with pBI101 vector) plants. Root diameter was measured with dial caliper by measuring the thickest root of each plant. Data were collected from transgenic carrot plants cultured in vitro for 3 months after planting and are the means ± standard deviation (SD) from three separate measurements of three individual plants.
표 Root morphology of SRD1 transgenic carrot plants. Microscopic observation of the transverse section of the roots from SRD1-transgenic and control (transformed with pBI101 vector) plants cultured in vitro for 3 weeks. Ct, Cortex; Mx, metaxylem; Pc, primary cambium
표 Taproot development in SRD1-transgenic carrot plants. SRD1 transgenic carrot plants were cultivated in soil for 3 months and taproot development was compared between SRD1-transgenic and control (transformed with pBI101 vector) plants. Root diameter was measured with dial caliper by measuring the thickest root of each plant. Data are the means ± standard deviation (SD) from three separate measurements of three individual plants.
표 Construction and identification of SRD2-smGFP vector for subcellular localization of SRD2 using particle bombardment.
표 Subcellular localization of SRD2 fused to GFP in epidermal onion cells. Cells were observed by green GFP fluorescence of the SRD2 protein and red propidium iodide (PI) fluorescence of the cell wall.
표 Construction and identification of SRD2-smGFP-1300 binary vector for subcellular localization of SRD2 using agroinfiltration
표 Subcellular localization of the SRD1-GFP fusion protein. Tobacco leaf abaxial epidermis cells transiently transformed with GFP- or SRD1-GFP were analyzed with a confocal laser scanning microscope. GFP signal image was merged with the image captured under light.
표 Nucleotide and amino acid sequences of SRD3.
표 Amino acid sequence similarity between SRD3 and other plant homologues.
표 Amino acid sequence alignment of ENOD93 proteins of sweetpotato (SRD3), rice (osENOD93), Glycine max (gmENOD93) and Datisca glomerata (DgENOD93).
표 Expression pattern of SRD3. (A) Developmental stages of sweetpotato. (B) RNA gel blot analysis of SRD3. Full-length SRD3 cDNA was used as a probe. The ethidium bromide-stained rRNA is shown as a loading control (lower panel). FR, fibrous root (diameter5cm); FR-MSR, fibrous root from mature storage root stage.
표 Construction and identification of PSRD1-SRD3 binary vector .
표 Generation of SRD3-transgenic carrot plants. (a) Induction of embryogenic calli from hypocotyls co-cultured with PSRD1-SRD3 and selected on the MS medium supplemented with kanamycin. (b and c) Regeneration of the calli. (d) Regenerated carrot plants.
표 Identification of transgenic carrot plants using PCR amplification. PCR amplification was conducted with genomic DNAs extracted from the putative transgenic carrot plants designated in each lane using EF1a and SRD3-specific primers. C, positive control amplified from tramsgenic carrot plants transformed by pBI101 only.
표 Transcript level of SRD3 in PSRD1-SRD3 transgenic carrot plants. Total RNA was extracted from taproot tissues of the transgenic carrot plants cultured in vitro for three months. PCR amplification was performed using SRD3-specific primers and EF1-α expression level was used as an internal equal-loading control. Error bars indicate the standard deviation (SD) between three technical replicates measured on taproots collected from at least three different transgenic carrot plants and subsequently pooled for analysis.
표 Taproot development in SRD3-transgenic carrot plants. SRD3 transgenic carrot plants were cultured in vitro for 3 months and taproot development was compared between SRD3-transgenic and control (transformed with pBI101 vector only) plants.
표 Thickening growth of taproots in SRD3-transgenic carrot plants. Root diameter was compared between SRD3-transgenic and control (transformed with pBI101 vector only) plants. Root diameter was measured with dial caliper by measuring the thickest root of each plant. Data were collected from transgenic carrot plants cultured in vitro for 3 months after planting and are the means ± standard deviation (SD) from three separate measurements of three individual plants.
표 Taproot development in SRD3-transgenic carrot plants. SRD3 transgenic carrot plants were cultivated in soil for 3 months and taproot development was compared between SRD3-transgenic and control (transformed with pBI101 vector) plants. Root diameter was measured with dial caliper by measuring the thickest root of each plant. Data are the means ± standard deviation (SD) from three separate measurements of three individual plants.
표 Characterization of carrot cDNA libraries. Carrot cDNA libraries were quantified using qPCR according to the Illumina qPCR Quantification Protocol Guide (a) and the size of PCR-enriched fragments were checked by running on an Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer using a DNA 1000 chip (b).
표 Summary of Illumina paired-end sequencing data generated for carrot root and taproot transcriptome.
표 Summary of carrot taproot transcriptome which have been preprocessed for de novo assembly.
표 Result of de novo assembly of carrot taproot transcriptome using CLC Assembly Cell
표 Summary of carrot taproot transcriptome assembly
표 Length distribution of contigs assembled from carrot root and taproot transcriptome sequences.
표 Verification of carrot transcriptome assembly using SRD1 sequence as reference.
표 Registration of carrot root and taproot transcriptome to the ENA (European Nucleotide Archive).
표 Summary of reads mapping
표 Van diagram of differentially expressed transcripts
표 GO annotation statistics
표 Gene ontology (GO) classification of upregulated transcripts during fleshy taproot development
표 GO classification of downregulated transcripts during fleshy taproot development.
표 Comparison of the gene ontology (GO) classification between down- and up-regulated transcripts during fleshy taproot development.
표 Enriched GO terms in the biological process for the carrot DEGs. GO terms were analyzed using 'TreeMap' view of REVIGO program (http://revigo.irb.hr/about.jsp). Each rectangle is a single cluster representative. The representatives are joined into 'superclusters' of loosely related terms, and visualized with different colors. Size of the rectangles reflects the p-value of the GO term obtained by singular enrichment analysis [SEA, AgriGO project (http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO)]. Asterisks represent GO terms specific to up- or downregulated DEGs.
표 Enriched GO terms in the molecular function for the carrot DEGs. GO terms were analyzed using 'TreeMap' view of REVIGO program (http://revigo.irb.hr/about.jsp). Each rectangle is a single cluster representative. The representatives are joined into 'superclusters' of loosely related terms, and visualized with different colors. Size of the rectangles reflects the p-value of the GO term obtained by singular enrichment analysis [SEA, AgriGO project http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO)]. Asterisks represent GO terms specific to up- or downregulated DEGs.
표 Enriched GO terms in the cellular component for the carrot DEGs. GO terms were analyzed using 'TreeMap' view of REVIGO program (http://revigo.irb.hr/about.jsp). Each rectangle is a single cluster representative. The representatives are joined into 'superclusters' of loosely related terms, and visualized with different colors. Size of the rectangles reflects the p-value of the GO term obtained by singular enrichment analysis [SEA, AgriGO project (http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO)]. Asterisks represent GO terms specific to up- or downregulated DEGs.
표 Transcript levels of differentially regulated genes during fleshy taproot development. Total RNA was extracted from the carrot taproots cultivated for 3 months in vitro. The primer sets listed in Table 1 were used. Expression levels were normalized to that of the
표 Functional annotation of 11 DEGs employed in qRT-PCR analysis.
표 yeast에서 BD-Atgla/KD, BD-Atg8a 단백질의 발현 확인
표 BD-Atg1a/KD (A), BD-Atg8a (B)의 2차 선별 결과
표 후보 유전자들의 vector 제작과 yeast 형질전환 확인
표 yeast 형질전환 후 선별배지에서 상호결합 재확인
표 pGBKT7 vector에 Atg1a/KD, Atg1a/C 제작 (A), Atg1a와 P1 단백질의 yeast 내 상호결합 확인 (B)
표 단백질 발현 vector 제작 (A), 재조합 단백질 분리 (B)
표 GST-P1과 His-ATG1a/KD (A), His-ATG1a/C (B) 단백질 간 in vitro binding assay
표 형질전환 후 colony PCR을 통한 발현 확인 (A), ATG8a와 상호작용하는 P2 유전자의 선별 배지에서의 생장 확인 (B)
표 단백질 발현 vector 제작 (A), 재조합 단백질 발현 (B)
표 유전자로 분리한 gene B (P5)에 대한 추가 실험을 진행하였다. 먼저 T-DNA knockout 돌연변이체의 종자를 ABRC로부터 분양 받은 후 PCR을 이용한 선별과정을 통하여 knockout 돌연변이체를 확보하였다. 일차적으로 Gene B 돌연변이 체에 박테리아 균주를 접종하여 이들 식물체의 형질을 관찰하였다 (그림 13). 그림 13. RT-PCR을 통한 돌연변이체 확인 및 야생형 애기장대에서 gene B의 발현 조사 (위), 박테리아균 접종에 따른 표현형 조사 (아래)
표 gene B 돌연변이체에서의 박테리아 생장곡선 (좌), ion leakage 측정 (우)
표 GFP를 이용한 gene B의 세포내 위치 확인
표 LTG을 이용한 자식소포체 관찰 (좌), FM4-1을 이용한 endocytosis 관찰 (우)
표 atg5-1 gene B 교배체에서 유전자의 발현 확인 (A), 생장비교 (B)
표 gene C knockout 돌연변이체, 과발현 형질전환체, 그리고 point mutation line (4-3 & 7-6)의 박테리아 병원균 처리에 따른 표현형 조사
표 박테리아 병원균 접종에 따른 atg1a, atg1b 돌연변이체의 표현형 조사
표 atg1a, atg1b 돌연변이체에서의 박테리아균 생장 측정
표 박테리아 균주 처리 후 ATG1a, ATG1b 유전자의 발현 변화
표 A. brassicicola 접종에 의한 식물 표현형 조사
표 A. brassicicola 접종에 따른 병변 크기 (좌) 및 포자수 (우) 측정
표 flg22 처리에 따른 callose 축적 관찰
표 LTG 염색방법을 이용한 자식소포체 관찰
표 atg1a의 노화 (A), chlorophyll 함량 (B), 노화관련 유전자 발현 (C) 분석
표 재조합단백질 His-ATG1a/C-term과 GST-ATG13a 정제 및 pull-down assay를 통한 상호결합 확인
표 yeast에서 발현시킨 ATG13a, ATG13b 와 ATG1a의 상호결합 확인
표 박테리아 병원균 Pst DC3000 (avrRpm1) 처리 후 14일째 표현형 (좌), spreading cell death 비율 측정 (우)
표 glip1-1 식물체에서 보이는 spreading cell death 현상 (위), glip1-1 식물체에서의 miRNA chip 분석 결과 및 miR164에 대한 northern blot 분석 (아래)
표 nac4-1 돌연변이체의 선별 (좌), 각 유전자의 과발현 식물체 제작 (우)
표 flg22 처리에 의한 callose deposition (좌), marker 유전자들의 발현 (우)
표 곰팡이 병원균에 대한 표현형 및 곰팡이 포자수와 병변 크기 조사 (위), 박테리아 병원균에 대한 표현형 및 생장속도 조사 (아래)
표 박테리아 병원균에 대한 HR cell death의 확산 및 이들 잎들의 빈도 (위), ion leakage 측정과 trypan blue 염색 (아래)
표 암처리에 의한 노화 정도의 차이 관찰
표 qRT-PCR을 통한 NAC4 발현 변화 분석. 낮은 농도의 박테리아 병원균 처리 후 접종 부위에서의 NAC4 발현 (좌), 높은 농도 처리후 발현 (중앙), 높은 농도 처리 후 처리하지 않은 건강한 조직에서의 발현 (우)
표 야생형 (위)과 mir164c-2 (아래)에서의 NAC4와 miR164의 발현 비교
표 2배 이상 발현 차이를 보이는 유전자들의 GO term 분석과 방어/세포사멸과 관련된 유전자의 수, 두 기능에 모두 관련된 유전자들의 목록
표 In vitro binding site 선별 실험 절차 (좌), 염기서열 분석 (우)
표 EMSA (좌), protoplast에서의 promoter-GUS 활성 분석 (우)
표 Promoter에 NAC4 결합 염기서열을 갖는 유전자들의 목록
표 유전자 발현 비교 (위), Chromatin-immunoprecipitation 분석 (아래)
표 GO term을 통한 유전자의 기능 분석
표 박테리아 병원균 접종 조직 (좌)과 접종되지 않은 건강한 조직 (우)에서의 유전자 발현 비교
표 mir164 돌연변이체의 병원균 접종 조직 (좌)과 접종되지 않은 조직 (우)에서의 유전자 발현 비교
표 RabG3bCA 과발현 형질전환 포플러의 생장 증가
표 RabG3bCA 과발현에 의한 포플러 물관부의 2차 세포벽 형성 증가
표 RabG3bCA 과발현에 의한 포플러 물관부/목재층의 바이오매스 증가
표 RabG3bCA 과발현에 의한 포플러 물관부 섬유세포 길이의 증가
표 야생형과 RabG3bCA 포플러(OX-3, OX-8)의 이차 세포벽 성분 분석
표 RabG3bCA 과발현에 의한 포플러 물관부의 자식작용 유도
표 RabG3bCA 과발현에 의한 포플러 자식소포체 형성 유도
표 촉매 전처리 전과 후 포플러 (WT, OX-3, OX-8)의 글루코오스 수율 조사
표 포플러 포트묘 육성
표 2012년 5월에 식재한 포플러 (좌)와 8월까지 생장한 포플러 (우)
표 포장 식재한 포플러의 길이 (좌)와 두께 (우) 비교
표 포장 1년차 포플러에서 RT-PCR을 통한 RabG3b 유전자의 발현 확인 (A), Western blotting을 통한 RabG3b 단백질의 발현 확인 (B)
표 phluoroglucinol-HCl 염색을 통한 목질부 관찰
표 섬유질의 길이 비교 (A) 및 현미경 관찰 사진 (B)
표 2012년 식재한 포플러의 2013년 3월 사진 (A), 2013년 포플러 식재 장소 (B) 및 식재 후 줄기와 뿌리가 유도된 포플러 사진 (C)
표 포장 식재 후 2013년 9월말 생장 모습 (A) 및 길이생장 조사 그래프 (B)
표 2013년 9월말 포플러 줄기 두께 비교 (A) 및 시기별 두께 조사 그래프 (B)
표 2013년생 포플러의 삽목 사진 (좌), 1년차 삽목 포플러 (중앙) 및 2년차 포플러의 식재 사진 (우)
표 포장 식재 후 8월말 생장모습, 1년차 (좌) 및 2년차 (우) 삽목 포플러
표 시기별 1년차 삽목 포플러 신장 (좌) 및 두께 (우) 조사
표 시기별 2년차 포플러 신장 (좌) 및 두께 (우) 조사

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