초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
1. OsSbe1 과발현 형질전환벼 계통 후대 육성
가. 초기세대에서 OsSbe1 유전자가 과발현된 형질전환체가 유전자의 도입 및 발현이 증가되는 것을 확인하였다.
나. 15 계통의 DNA를 추출한 후 Southern analysis를 통해 6 계통이 single copy인 것으로 확인되었다.
다. Single copy가 확인된 계통을 이용하여 real-time PCR 분석을 통해 형질전환체의 발현 증가를 조사한 결과 모든 형질전환체에서 모품종인 고품벼에 비해 발현량이 증가하였다.
라.

Ⅳ. 연구개발결과
1. OsSbe1 과발현 형질전환벼 계통 후대 육성
가. 초기세대에서 OsSbe1 유전자가 과발현된 형질전환체가 유전자의 도입 및 발현이 증가되는 것을 확인하였다.
나. 15 계통의 DNA를 추출한 후 Southern analysis를 통해 6 계통이 single copy인 것으로 확인되었다.
다. Single copy가 확인된 계통을 이용하여 real-time PCR 분석을 통해 형질전환체의 발현 증가를 조사한 결과 모든 형질전환체에서 모품종인 고품벼에 비해 발현량이 증가하였다.
라. Single copy가 확인된 6계통을 이용하여 hiTAIL-PCR 방법을 통해 T-DNA 삽입 부위를 알아보고자 하였다. 180302 계통의 경우 벼의 8번 염색체 내에 위치하는 두 유전자의 사이에 (intergenic으로) 삽입되었다.
마. 고품벼의 경우 아밀로스 함량이 약 19%이상으로 나타났으나, 대부분 형질전환 계통이 약 17% 내외의 아밀로스 함량을 보였으며 일부 높은 아밀로스 함량을 보이는 계통도 있었다.
바. 농업형질과 수량구성요소 및 수량을 wild type 고품벼와 형질전환 벼에 대하여 조사한 결과 형질전환체의 수장이 고품벼에 비해 길었고, 분얼수 또한 증가하였으며, 등숙률 및 천립중도 높게 나타났다. 이와 같은 결과는 단위면적당 정조 수량을 증가시키는 결과를 초래한 것으로 판단된다.
사. 180302 계통은 목표유전자가 벼에 single copy로 존재하며 유전자의 발현이 모품종에 비해 증가되었고, 삽입하고자 하는 T-DNA가 다른 유전자내로 삽입이 되지 않았기 때문에
이벤트(Event)로서의 가능성을 가지고 있다고 판단된다.
2. RNAi, Antisense를 통한 SSS1, GBSS1 유전자 발현 제어
가. RNAi 기술을 통해 GBSSI 유전자를 조절한 결과, RNAi-GBSSI 형질전환체의 유전자 발현이 현저하게 줄어들었으나 아밀로스 함량 또한 급격히 감소하여 본 연구에서 원하는 저 아밀로스 함량의 라인을 선발하기에 어려움이 있다.
나. RNAi 기술을 통해 SSSI 유전자를 조절한 결과, RNAi-SSSI 형질전환체의 유전자 발현이 현저하게 줄어들었으며 12~18% 정도의 다양한 Amylose 함량분포가 나타났다.
다. antisense-SSSI과 antisense-GBSSI 형질전환체에서도 9.12~16.36%과 9.21%~18.74% 정도의 다양한 아밀로스 함량이 나타났다.
라. 요오드 염색법을 이용하여 아밀로스 함량을 살펴본 결과, 고품벼는 청남색 반응을 보였으나, RNAi-GBSSI 형질전환 계통은 적갈색을 RNAi-SSSI, antisense-SSSI, GBSSI의 형질 전환체에서는 고품벼보다는 옅은 청남색을 나타내어 모품종과는 뚜렷한 차이를 보였다.
마. 전자현미경을 이용하여 전분립 구조를 분석한 결과 고품벼의 경우 절단면에 나타난 전분립의 쪼개짐이 뚜렷하고 다양한 모양의 크기가 다른 전분립 구조를 보인 반면 RNAi, antisense 형질전환 계통은 전분립의 크기가 작아지고 날카로운 각과 모서리가 없는 완만한 굴곡의 단면 형태를 나타냈다.
바. RNAi-SSSI 형질전환계통 10개중 6계통에서 single copy로 나타났고, hiTAIL-PCR 방법을 통해 T-DNA 삽입 부위를 알아본 결과 651 계통의 경우 벼의 2번 염색체 내에 위치하는 두 유전자의 사이에 (intergenic으로) 삽입됨을 확인하였다.
사. RNAi와 antisense를 이용하여 SSSI , GBSSI 유전자의 발현을 조절하였고, 그 결과, 전분 합성에 영향을 주는 아밀로스 함량이 감소되었고, 전자현미경 분석 결과 전분립의 형태에도 영향을 주었기에 이를 이용하여 식미 향상을 위한 육종단계에 중간 모본으로 사용할
수 있을 것으로 사료된다.
3. ZFN 기술을 이용한 유전자 변이체 발현연구 (SSS4)
가. ZFN::SSS4A 벡터를 구축하여 형질전환체를 분석한 결과 SSS4A 유전자내 염기서열이 결실되어 다양한 SSS4A 단백질을 만들어 낼 것으로 보여짐. SSS4A유전자 염기서열이 결실 된 단백질이 세포내에서 기능적으로 전분합성에 영향을 끼칠 것으로 판단된다.
나. ZFN::SSS4A 유전자가 도입된 ZFN vector 두 종류 (pTA7002, PGDI)를 Agrobacterium 방법으로 식물체내 도입 하여 형질전환체를 육성하고, 그 후대 T1 세대로부터 유전자 도입 여부를 확인하고, ZFN 활성을 검정하였다. 그 결과 pTA7002 vector가 삽입된 형질전환체 64개의 T1 세대 중 44개의 형질전환 개체들에서 pTA7002::ZFN::SSS4A vector가 안정적으로 도입되었다.
다. PGD1 vector가 삽입된 16개체를 선발하여 PCR분석을 한 후 ZFN의 활성을 검정하기 위해 T7E1 assay를 수행한 결과 16개 형질전환체 개체들에서 ZFN 활성이 확인. 염기서열 분석 결과 ZFN::SSS4A 의 target region에서는 최소 1 bp에서 최대 45 bp의 염기들이 delection 되었으며, 10번 개체에서는 2개의 염기가 치환되어있는 상태를 확인하였다.
라. 선발된 ZFN::SSS4A 도입 형질전환 T1 세대의 후대 육성방안 연구를 위해 농업형질을 분석한 결과 pTA7002::SSS4A::ZFN vector가 도입된 #8번에서 #12번은 종자의 획득만 저조할 뿐 다른 형질은 wild type과 유사하였으나, pPZP::SSS4A::ZFN vector가 도입된 #1번에서 #7번은 항시발현하는 PGD1 promoter의 영향으로 모두 왜성(dwarf)의 특징을 보였으며 분얼 수도 많고, 종자 획득이 불가능하다.
마. 이상의 결과를 바탕으로 좀 더 깊이 있는 연구를 수행하여 전분대사생합성의 메카니즘을 분석하고 본 개체들의 후대육성을 통하여 농업적으로 유용한 자원을 확보할 수 있는 연구의 기반이 될 것으로 판단된다.

Abstract ▼

There is a great consideration on rice eating quality aside from improving its tolerance to various stresses. High yielding and pest and disease tolerant rice is highly desirable but it is more commercially important if it also has a high eating quality. Eating quality of rice attracts more and more

There is a great consideration on rice eating quality aside from improving its tolerance to various stresses. High yielding and pest and disease tolerant rice is highly desirable but it is more commercially important if it also has a high eating quality. Eating quality of rice attracts more and more attention from rice-eating consumers in the recent years. Thus, improvement of eating quality of cooked rice has become one of the most important breeding goals in japonica rice. The generation of transgenic japonica rice with improved eating quality and grain yield are reported. Overexpression of OsSbe1 gene encoding rice starch branching enzyme 1 was driven by 35S promoter. The independent homozygous transgenic lines were characterized and had shown higher palatability (71.2 -72.6) than wild type Gopum (70.4). Moreover, transgenic rice lines showed an increase in 1000 grain weight and number of spikelets per panicle compared with the wild type. Gene expression analyses in mRNA transcription and enzyme activity levels suggest that improved eating quality is due to the up-regulation of OsSbe1 gene.
There are various factors contributing to the good eating quality of rice. This study focuses on modifying the expression of SSS1 and GBSS1 genes which are responsible for amylopectin and amylose synthesis in rice by using RNA interference (RNAi) and antisense (AS) techniques. To increase the palatability of rice, RNAi and antisense could be an excellent and powerful tool for controlling the starch composition which is responsible for grain eating quality. The main vector used for each antisense and RNAi targeting SSS1 and GBSS1 genes is pCAMBIA1300. Hygromycin phosphotransferase gene (HPT) is included under the control of 35S promoter to enable hygromycin-based plant selection. Rice cultivar, Gopumbyeo, was transformed by Agrobacterium tumefaciensmediated transformation using embryogenic calli. Genomic PCR was carried out using HPT marker gene and target gene. A total of 69 transgenic plants were generated with RNAi-SSS1 gene, 73 with antisense-SSS1 gene, 40 transgenic plants with RNAi-GBSS1 gene and 60 with antisense-GBSS1 gene. A semi-quantitative RT-PCR was carried out to measure the expression level of SSS1 and GBSS1 gene at several time points after the flowering of transgenic plants. The expression level of SSS1 gene in rice grains decreases over time with the same trend of its wild type Gopum. Significantly, at 29 DAF the expression of SSS1 gene is relatively lower compare to the wild type. For GBSS1 gene, the mRNA expression among the transgenic plants were lower compare to its wild type and thus showing the same effect with the action of RNAi in SSS1 gene. The enzyme activities of starch branching enzyme (SBE), granule bound starch synthase (GBSS1), and soluble starch synthase (SSS) in developing rice grain were also carried out. The activities of SBE and SSS were higher than that of the WT compare to RNAi-SSS1 transgenic plants. The activities of GBSS1 were higher in RNA-SSS1 than of WT. The activities of SBE and SSS were lower than that of the WT compare to RNAi-GBSS1 transgenic plants. The activities of GBSS1 were lower in RNA-GBSS1 than of WT. To quantify the change in amylose content, T1 seeds were subjected to amylose content analysis. Findings from this analysis prove the successful mode of action of RNAi and antisense by lowering the AC of transgenic seeds. scanning electron microscopy (SEM) analysis revealed uniform size with smooth curves starch granules in down-regulation rice lines, in contrast with the non-uniform granules in wild type. In summary, the transgenic lines produced low amylose contents that fell between glutinous and nonglutinous rice, accompanied with changes in physicochemical properties of rice grains. This study showed that downregulation of endogenous GBSSI, SSSI through RNAi or antisense is an invaluable technique that could aid in developing rice variety with improved eating quality.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 8
• 목차 ... 10
• 제 1 장 서 론 ... 11
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 14
• 제1절. 국내 연구 현황 ... 14
• 제2절. 국외 연구 현황 ... 15
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 19
• 제 1 절. OsSbe1 과발현 형질전환 벼 계통 후대 육성 ... 19
• 1. 전분대사 관련 pathway 유전자의 발현연구 ... 19
• 2. OsSbe1 과발현 형질전환체를 이용한 교배조합 육성 ... 43
• 3. 종자특이 프로모터에 의한 유전자 발현 조절 ... 46
• 제 2 절. RNAi 및 antisense 등 유전자 발현제어를 통한 우량 전분대사 증진 벼 육성 ... 49
• 1. RNAi를 통한 SSS1, GBSS1 유전자 발현 제어 ... 49
• 2. GBSS 유전자 발현제어 연구 ... 58
• 3. SSSI 유전자 발현제어 연구 ... 68
• 제 3 절. ZFN 기술을 이용한 유전자 변이체 육성 ... 82
• 1. 벼 전분대사 관련 SSS4A 유전자의 구조분석 ... 82
• 2. ZFN::SSS4A 벡터을 이용한 형질전환 벼 육성 및 발현분석 ... 90
• 3. ZFN::SSS4A 벡터의 형질전환체 육성 ... 93
• 4. ZFN::SSS4A 도입 형질전환 T1 세대 육성 ... 98
• 5. ZFN::SSS4A (PGDI vector) 도입 형질전환 T1 세대에서 ZFN 활성 검정 ... 100
• 6. ZFN::SSS4A 도입 형질전환 T1 세대 육성 ... 103
• 7. ZFN::SSS4A 도입 형질전환 T1 세대의 유전자 도입 및 염기서열 분석 ... 104
• 8. ZFN::SSS4A 도입 형질전환 T1 세대의 유전자 도입 위치 분석 ... 105
• 9. ZFN::SSS4A 도입 형질전환 T2 세대 육성 ... 107
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 109
• 제 1 절. 목표대비 대외 달성도 ... 109
• 제 2 절. 정량적 성과 ... 110
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 111
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 112
• 제 7 장 기타 중요 변동사항 ... 112
• 제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비현황 ... 112
• 제 9 장 참고문헌 ... 113
• 끝페이지 ... 116