보고서 정보
주관연구기관 |
서강대학교 Sogang University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2015-02 |
과제시작연도 |
2014 |
주관부처 |
농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 |
TRKO201500010231 |
과제고유번호 |
1395035615 |
사업명 |
차세대바이오그린21 |
DB 구축일자 |
2015-07-11
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201500010231 |
초록
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Ⅳ. 연구개발결과
1) 내냉성이 증진된 T-DNA 활성화 및 삽입변이주의 선발 및 기작 연구
환경스트레스 반응에서 중요한 역할을 차지하는 E3 ubiquitin ligase (E3)에 대한 대규모 검정으로부터 최종적으로 내냉성이 증진된 5 계통을 선발하였고 이 들의 내재해성을 조사하여 일부 계통에서 내냉성 이외에도 내염성, 내건성이 증진됨을 확인하였다.이 중, 복합내재해성이 증진된 E3A126 계통을 심층 연구하였다. 한편 이들 5계통의 해당 유전자에 대한 형질전환체를 만들고, 발현을 확인하였으며 자가 증식하여 T1 개체
Ⅳ. 연구개발결과
1) 내냉성이 증진된 T-DNA 활성화 및 삽입변이주의 선발 및 기작 연구
환경스트레스 반응에서 중요한 역할을 차지하는 E3 ubiquitin ligase (E3)에 대한 대규모 검정으로부터 최종적으로 내냉성이 증진된 5 계통을 선발하였고 이 들의 내재해성을 조사하여 일부 계통에서 내냉성 이외에도 내염성, 내건성이 증진됨을 확인하였다.이 중, 복합내재해성이 증진된 E3A126 계통을 심층 연구하였다. 한편 이들 5계통의 해당 유전자에 대한 형질전환체를 만들고, 발현을 확인하였으며 자가 증식하여 T1 개체들을 확보하였다.
- E3A126 계통의 스트레스 내성 확인
E3A126 계통의 내재해성은 저온, 염, 건조 스트레스에 모두 강한 것으로 나타났으며, 더불어 벼의 흰잎마름병과 도열병에 대한 내병성도 증진된 것을 밝혀내었다.
- 내재해성 E3A126 계통의 T-DNA 태깅 연구
내재해성 E1A126 계통의 T-DNA 태깅 부위를 확인한 결과, T-DNA는 Os01g11520유전자 하류에 삽입된 것을 알아내었고, Os01g11520 유전자의 계통분석을 통하여Aarabidopsis의 ATL41(AT2G42360)과 41%의 아미노산 동질성을 가짐을 알 수 있었다.ATL41은 E3 리가아제 중 보존된 N-말단 부위, GLD 부위 및 RING-H2 도메인을 갖는ATL(Arabidopsis Toxicos en Levadura) 패밀리로, Os01g11520는 ATL 패밀리의 정의에부합하여 Serrano et al.(2006)에 따라 OsATL5로 명명하였다. OsATL5 유전자의 발현은RT-PCR과 qRT-PCR 결과 E3A126 계통에서 OsATL5의 발현이 야생형보다 매우 높은것을 증명하였다.
- OsATL5의 발현 분석
E3A126 계통은 높은 스트레스 내성을 나타내므로, OsATL5 유전자가 스트레스에의해 유도되는지 조사한 결과, 저온 스트레스에 의한 발현 유도는 크지 않았으나. 염,건조 및 ABA 처리에 의해 OsATL5 전사체의 발현 정도가 증가하는 것을 알 수 있었다.한편, 다양한 조직 과 발생단계에서 OsATL5의 발현 패턴을 조사한 결과이삭(panicle)에서 전사체가 많이 발현됨을 보였다.
- OsATL5은 E3 유비퀴틴 리가아제를 코딩하며 OsATL5 단백질은 ER에 위치한다
OsATL5는 C-말단에 징크 핑거-H2-형 RING 도메인을 갖기 때문에, E3리가아제로서 기능할 것으로 예상하고 in vitro 자가-유비퀴틴화 분석을 수행한 결과OsATL5 단백질은 E3 유비퀴틴 리가아제 활성을 가지는 것으로 나타났으며, 또한OsATL5 단백질의 세포 내 위치를 구하기 위해, Ubi 프로모터 아래 OsATL5의 3’말단에형광 마커인 sGFP를 in-frame 재조합하여 옥수수 원형질체와 양파 표피세포에서발현시킨 결과 OsATL5와 관련된 형광은 소포체(Endoplasmic reticulum)의 막에위치하는 것으로 판단되었다.
- E3A126의 마이크로어레이 분석과 병저항성
내재해성을 나타내는 E3A126 계통의 내재해성 기작을 이해하기 위하여마이크로어레이를 수행한 결과 발현이 감소되는 40여개의 유전자와 발현이 증가하는100여개의 유전자를 동정하였고 흥미롭게도 병저항성과 관련된 Pathogenesis-Related(PR) 유전자들의 발현이 증가함을 알 수 있었다. 따라서 흰잎마름병과 도열병에 대한내병성 검정을 한 결과 E3A126 계통은 두 병 모두에서 내병성이 향상된 것을밝혀내었다.
2) 내염성이 증진된 T-DNA 활성화 변이주 선발 및 기작 연구
T-DNA 활성화 변이주 pool의 내염성 검정으로부터 2 계통의 내염성이 뛰어난 계통을선발 고정하였으며, 이 들 계통의 분자생리유전학적 연구를 수행하였다. T-DNA 삽입위치를 확인하였으며 T-DNA 삽입 주변 유전자들의 발현 양상과 활성화된 유전자 1종의코딩 단백질 활성 증가를 확인하였다. 또한 이 들 변이주의 유전자형에 대한 내염성co-segregation 연구를 수행하여 내염성 유전자를 밝혀내었다.
○ 내염성 활성화 변이주 07A503의 분리 및 분자생리유전학적 연구
- 07A503 계통은 야생형 동진벼에 비해 월등한 내염성을 나타내었다. 염스트레스처리에 의한 광합성계의 손상은 동진벼에 비해 적었으며, 축적되는 과산화수소수의양도 비교적 낮은 것으로 나타났다. 이 변이주에서는 Aconitase 유전자인 OsAco1의하류에 태깅되었고, 후손들의 유전자형을 결정하였다.
- 07A503 계통의 삽입 주변 유전자에 대한 발현 분석을 실시한 결과, OsAco1 유전자의 발현이 증가됨을 알 수 있었으며, 정량적 분석결과 약 2.5배의 발현 증가를 확인하였다. 한편, 07A503 계통의 aconitase 효소 활성을 조사한 결과 약 6배 이상의 활성 증가가 일어났다. 또한 조직 및 발달단계에 따른 OsAco1의 발현은 거의 모든 조사된 조직과 발달 단계에서 발현되고 있음을 알 수있었다. 스트레스에 의한 발현 변화를 조사한 결과 저온을 제외한 건조와 염, 그리고 ABA에 의해서 발현이 유도됨을 알 수 있었지만 그 발현 유도 양상은 조금씩 다른 것으로 나타났다.
- OsAco1과 내염성의 co-segregation 분석을 통하여, 내염성이 OsAco1 의 발현변화때문인지를 연구하고자 유전자형이 결정된 후손들에 대한 내염성 검정을 수행한 결과동진벼와 segregant 야생형과 달리 T-DNA 이형접합체나 동형접합체 모두 내염성이 높은 것으로 나타남으로써, OsAco1 이 우성으로 내염성 형질에 작용하고 있음을 알 수있었다. 또한 OsAco1 활성화변이주인 07A503의 allelic mutant를 선발하여 OsAco1 유전자의 상류에 T-DNA가 삽입된 것을 확인하였으며, 이 식물체에서OsAco1가 약 4배에서 9배 정도 발현이 증가됨을 확인하여 올해 이 식물체를 증식하였으며 내염성을 검정할 예정이다.
○ 내염성 활성화 변이주 07A723의 분리 및 분자생리유전학적 연구
- 07A723 계통은 유전체의 3군데에서 T-DNA 가 삽입되어 있었으며. 이들 삽입 부위의 유전자에 대한 발현 분석을 실시한 결과, 기능이 밝혀져 있지 않은 Os06g43080유전자의 발현이 증가됨을 알 수 있었고 OsSta1 (Oryza sativa Salt toleranceactivation 1)으로 명명하였다.
- OsSta1 은 기존에 알려지지 않은 단백질 도메인을 갖고 있으며, 몇 몇 종의 단백질과 유사성을 갖고 있는 것으로 나타났다. 조직별 발달단계별 그리고 다양한 스트레스 처리에 의한 발현 양상을 조사한 결과 염과 건조, 그리고 ABA 에 의해서 발현이 유도되는 것으로 나타났으나, 저온에 의한 발현 유도는 미약하였다. 기관별 발현에서는 특히이삭(panicle)에서의 발현이 다소 높은 것으로 나타났다. OsSta1 의 정량적 유전자 발현분석결과 약 7 배의 발현 증가를 확인하였고, 유전자형 분석을 통하여 분리 집단을 확보하였으며, allelic mutant 4 종을 수집하여, 그 중 1 종에서 유전자활성을 확인하였다.
3) 내재해성이 증진된 형질전환체의 제작 및 분석
○ 스트레스 유도성 OsDhn1 유전자의 과발현 형질전환체의 내염/내건성 연구
- 내건성에 중요한 것으로 알려진 dehydrin 단백질을 벼에서 과다발현 시키고, T3세대에서 내재해성을 종합적으로 검정하였다. 그 결과, OsDhn1 -OX의 내냉성은 야생형과 비슷하였지만 내건성과 내염성은 높은 것으로 밝혀졌다.
- OsDhn1 형진전환체의 OsDhn1 유전자 과발현 정도는 RNA 혼성화 실험을 통해전사수준에서 연구하였고, 또한 Western 실험을 통하여 단백질 수준에서도 32 kD 정도의 크기인 OsDhn1 단백질이 형질전환체에서 많이 만들어짐을 알 수 있었다. 내재해성 메커니즘을 이해하기 위하여 건조스트레스와 염스트레스 과정에서 형질전환체의 생리생화학적인 변화를 조사해본 결과, 양 스트레스 모두에서 야생형인 대조구에 비해형질전환체에서의 생체량, 건량 및 광계II, 엽록소 및 카로티노이드 함량이 더 높음을알 수 있었다. 또한 활성 산소를 만들어내는 MV 처리후에도OsDhn1 형질전환체들은대조구인 야생형 동진벼에 비해 더 높은 엽록소 함량과 광계II를 나타냄을 알 수 있었다
- OsDhn1의 내재해성 기작을 이해하기 위하여 스트레스 처리 후 식물체내에 형성되는 활성산소인 과산화수소수의 양을 측정한 결과, 양 처리 후 약 2시간 후에 형질전환체의 활성산소양이 대조구인 동진벼에 비해 적음을 알 수 있었다. 따라서 OsDhn1 형질전환체의 내재해성은 직접적으로 혹은 간접적으로 활성산소의 양을 줄여줌으로써 내재해성을 갖는 것으로 추론할 수 있었다.
○ 염, ABA 유도성 OsGASR1 유전자 과발현 형질전환체의 내염성 연구
- 벼의 T-DNA 태깅 돌연변이 집단의 대량검정을 통해 얻게된 GAST (GA-stimulated transcript) family 유전자인 OsGASR1 은 염 과 ABA에 의해서 발현이 유도됨을 알았고,따라서 이 유전자의 기능을 알기 위하여, 과발현 형질전환체를 제작하여 스트레스 내성을 검정하였다. 그 결과 OsGASR1 형질전환체는 자가증식에서 분리되는 야생형에 비해 내염성이 증진되었음을 알 수 있었다. 뿐만아니라 이 유전자를 과발현시킨 대장균세포가 대조구 세포에 비해, 활성 산소인 NO에 대해 상당히 높은 생장률을 나타내는것을 알 수 있었고 형질전환 식물의 경우에는 염 스트레스 처리 후 축적되는 과산화수소수의 양이 대조구인 야생형에 비해 약 25% 낮음을 알아내었다. 따라서 OsGASR1은염 스트레스반응에서 중요한 역할을 할 것임을 제안하였다.
○ 전사 조절인자 OsERF6 유전자의 과발현 형질전환체의 내염성 연구
- OsERF5는 microarray db 검색으로부터 선발된 스트레스 유도성 전사조절인자 유전자 7종 중 하나이며, 비생물 스트레스에 의해 발현이 유도되는 것으로 나타났고, 조직별 발현 조사에서는 특히 이삭에서 발현이 많은 것으로 확인되었다(Fig. 18). 다수의전사조절인자들을 형질전환시켰고, 이들 형질전환체 중 OsERF6 유전자의 과발현 형질전환체가 내염성과 내건성이 우수한 계통으로 최종 선발되었다(Table 3). 현재 이 유전자의 활성변이주를 확보하였으며, 이들 계통에서 내재해성 메커니즘을 심층 연구하고있다.
Abstract
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For the development of abiotic stress tolerant genetic resources, we have screened T-DNA activation tagging pool as well as transgenic lines generated from rice. From the screening, two activation lines, ATL07503 and ATL07723, were identified for their salt stress tolerance and 5 lines including E3A
For the development of abiotic stress tolerant genetic resources, we have screened T-DNA activation tagging pool as well as transgenic lines generated from rice. From the screening, two activation lines, ATL07503 and ATL07723, were identified for their salt stress tolerance and 5 lines including E3A126 for their multiple stress tolerance, a transgenic OsDhn1 line for salt/drought tolerance, another transgenic line of OsGASR1 for salt tolerance. Molecular physiogenetic study revealed that two novel genes, OsAco1 and OsSta1, acting in dominant manner were identified as cosegregating genes with the salt tolerance in the salt tolerant activation lines. In-depth study of the multiple stress tolerant E3A126 revealed that an activated OsATL5 gene is responsible for the stress tolerance. OsATL5 encodes E3 ubiquitin ligase with RING finger domain and OsATL5 protein was found at ER in the cell.
Microarray analysis linked to individual expression study also showed that activation of OsATL5 enhanced the expression of pathogenesis related genes. The activation plants indeed biotic stress tolerance to bacterial blight and fungal leaf blight.
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