보고서 정보
주관연구기관 |
충북대학교 Chungbuk National University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2015-02 |
주관부처 |
농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 |
TRKO201500010579 |
DB 구축일자 |
2015-07-11
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초록
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Ⅳ. 연구개발결과
1. 제 1 세부연구과제
Mophology of FGF4 & LIF Treated Cell. 돼지 난자를 체외수정을 실시 후 제 7일째 배반포를 이용하여 TS줄기세포와 ES줄기세포를 유도하였다. TS줄기세포 sms FGF4로 유도하였고, ES줄기세포를 LIF로 유도하였다, 유도초기상태는 구분하기 힘든 상태이고 분화 12일째 및 24일째에는 각각 TS줄기세포와 ES줄기세포 형태적으로 비슷하게 나타났다. 체외수정난으로부터 얻어진 배반포를 배아줄기세포를 유도한 후 배아줄기세포 특유의 유전자발현을 면역현광분석법
Ⅳ. 연구개발결과
1. 제 1 세부연구과제
Mophology of FGF4 & LIF Treated Cell. 돼지 난자를 체외수정을 실시 후 제 7일째 배반포를 이용하여 TS줄기세포와 ES줄기세포를 유도하였다. TS줄기세포 sms FGF4로 유도하였고, ES줄기세포를 LIF로 유도하였다, 유도초기상태는 구분하기 힘든 상태이고 분화 12일째 및 24일째에는 각각 TS줄기세포와 ES줄기세포 형태적으로 비슷하게 나타났다. 체외수정난으로부터 얻어진 배반포를 배아줄기세포를 유도한 후 배아줄기세포 특유의 유전자발현을 면역현광분석법으로 확인. 지지세포는 배아줄기세포의 증식에 필요한 성장인자들을 공급하여 주고 배아 줄기세포의 분화를 억제시킨다. 주된 분화억제 요소로는 백혈병억제인자(LIF)를 이용하며 LIF는 다발현성 사이토카인(cytokine) 으로 gp130 pathway에 작용하며, 이는 CNTF, OSM, IL-6 등의 사이토카인과 함께 배아 줄기세포가 다능성을 유지면서 증식할 수 있도록 해준다.
형질전환복제배아에서의 on/off 시스템 정상적인 유전자발현확인. 형질전환배아에서 Tet on/off 시스템을 확인 위하여 형질전환세포주에 테트라싸이클린은 처리하여 GFP유전자의 발현을 현광현미경으로 관찰한 후 체세포핵이식 기법으로 형질전환복제배아를 생산하여 후기 배아발달과정에 GFP유전자 발현을 확인 하였으며, 배아의 전반 발달과정에서 특히 배반포에서도 정상적인 GFP유전자 발현을 확인 할 수 있었다. 형질전환복제배아 이식전 대리모에 이식하고 이식 후 35일령에 임신초음파검진하였으며, 84일령 임신유지 및 임신 전 113일령 분만 전에도 초음파로 확인하였다. Tet on/off 시스템에 의한 형질전환 돼지의 성공적인 생산 및 태여난 형질전환복제돼지의 태반와 태줄의 GFP유전자 발현을 RT-PCR로 확인결과 태반과 태줄에서 GFP유전자가 전부 들어 있음을 확인하였다. 태어난 tet on/off GFP형질전환복제돼지의 사료에 doxycycline을 첨가하여 급여하였을 돼지에서 GFP유전자의 발현. 형광하에서 돼지의 발굽에 GPF 유전자가 발현되는 것이 확인되었다.
2. 제 1 협동연구과제
배아 줄기세포는 미분화된 배아 줄기세포와 분화된 배아 줄기세포의 특징을 알기위해 흔히 사용되는 세포 표지인자를 조사하였다. 미분화된 상태를 나타내는 표지인자는 생쥐 속세포덩이의 비특이적 alkaline phosphatase와 동일한 alkaine phosphatase이다. 일반적으로 다른 표지인자들은 ECMA-7, SSEA-1을 포함한 막단백질의 당잔기 부분을 억제 하였다.
매기벡터는 총 1.9kb의 돼지유전자DNA와 동족의 TALEN 상대위치를 같이 한다. 현재 야생돼지섬유아세포에서 이 벡터의 GalT상대위치 제거와 도입효과를 확인하고 있다. TALEN과정을 촉진하기 위하여 우리는 Amaxa Nucleofector 구매하여 현재 사용중인유전자도임시스템을 대체하였다. 본유전자도입시스템을 이용하여 원래 원시세포내 유전자도입효율 10-20%에서 60-100% 상승시켰다. 또한 양성세포분리방법도 개선하였다. Westran돼지 귀조직으로부터 성공적으로 각각 3가지 자웅성섬유아세포를 구축하였다. 각세포를은 계대배양후 동결보존하였으면 그중 2가지 세포주로 핵이식에 사용하였다. 그리하여 복제배아를 이용하여 성공적으로 자성와웅성유래 배아줄기세포를 분리하는데 성공하였으며, 계대배양후 동결보존하고 있고, 해동후 배아줄기세포이 만능성에 대하여 검증하였다.
Abstract
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II-1. Specification No.1
Transgenic (TG) pigs generated using assisted reproductive techniques are a major research tool in xenotransplantation, disease models, and bioreactors. However, in TG pigs generated using the standard procedure, the expression of the transgene is controlled by tissue-spe
II-1. Specification No.1
Transgenic (TG) pigs generated using assisted reproductive techniques are a major research tool in xenotransplantation, disease models, and bioreactors. However, in TG pigs generated using the standard procedure, the expression of the transgene is controlled by tissue-specific or ubiquitously expressed promoters. In some TG pigs generated using the standard procedure, organ function and embryo developments are abnormal; for example, overexpression of an exogenous GH gene causes a range of pathophysiological abnormalities. The Tet-on system was then tested in the generated porcine SCNT-TG embryos. PCR analysis showed that the transgene was inserted into the genome of each of these piglets. Two TG fibroblast cell lines were established from these TG piglets, and these cells were used as donor cells for re-cloning. The re-cloned SCNT embryos expressed the eGFP transgene under the control of doxycycline. These data show that the expression of transgenes in cloned TG pigs can be regulated by the Tet-on/off systems.
Total of 125 miRNAs and 2394 mRNAs were differentially expressed between androgenetic ESCs (aESCs) and fertilized ESCs (fESCs), a total of 42 miRNAs and 87 mRNAs were differentially expressed between parthenogenetic ESCs (pESCs) and fESCs, and a total of 99 miRNAs and 1788 mRNAs were differentially expressed between aESCs and pESCs. In addition, a total of 575, 5 and 376 miRNA-mRNA target pairs were observed in aESCs vs. fESCs, pESCs vs. fESCs, and aESCs vs. pESCs, respectively.
We also detected more than 800 proteins on silver- stained gels of whole protein extracts from each type of ESC. Of these, 52 differentially expressed proteins were identified by the MALDI–TOF/TOF analyzer, including 32 (fESCs vs. pESCs), 28 (fESCs vs. aESCs) and 17 (pESCs vs. aESCs) prominent proteins with significantly higher or lower expression relative to the comparison cells. Among the 32 proteins from fESCs, 12 were significantly increased in expression and 20 were reduced in expression in fESCs com-pared with pESCs. Similarly, 10 of 28 and 8 of 17 proteins were more highly expressed in fESCs and pESCs compared with aESCs, respectively. In contrast, 18 of 28 and 9 of 17 proteins were reduced in expression in fESCs and pESCs compared with aESCs, respectively.
II-2. Specification No.2
We developed a new method for isolating embryonic stem cells and used this to isolate porcine embryonic stem cell. In characterizing these cells we produced chimeric pigssuggesting that these cells are closer to naive mouse ESCs. We have also developed protocols for differentiating these to cell types representative of all three germ layers. This included pancreatic endoderm which can be differentiated further to insulin producing cells. Similar human ESC derived cells are about to enter phase I trials as a cell based therapy for Type I diabetes. The use of pig ESC derived cell types have the potential to accelerate this and other stem cell based cell therapies by allowing cell therapy approaches to be modeled in the pig first. In developing this model we have also isolated ESCs from the Western pig.
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