초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
1. hGH 유전자가 발현되는 virus vector system의 in vitro 검정
본 연구실에서 구축한 pLNC-hGHW를 GP2 293 세포에 도입한 후, pVSV-G를 일시적으로 transfection하여 virus를 생산하였다. 생산한 virus를 표적세포인 CEF와 CHO 세포에 감염시켜서 각 세포에서 RNA를 분리하여 RT-PCR을 실시한 결과, virus에 감염되지 않은 정상 세포에서는 외래 유전자의 도입이 나타나지 않았으며 각 virus에 감염된 세포에서만 외래 유전자의 전사가 확인되

Ⅳ. 연구개발결과
1. hGH 유전자가 발현되는 virus vector system의 in vitro 검정
본 연구실에서 구축한 pLNC-hGHW를 GP2 293 세포에 도입한 후, pVSV-G를 일시적으로 transfection하여 virus를 생산하였다. 생산한 virus를 표적세포인 CEF와 CHO 세포에 감염시켜서 각 세포에서 RNA를 분리하여 RT-PCR을 실시한 결과, virus에 감염되지 않은 정상 세포에서는 외래 유전자의 도입이 나타나지 않았으며 각 virus에 감염된 세포에서만 외래 유전자의 전사가 확인되었다. 모든 세포에서 정상적인 전사 과정이 일어나고 있음을 확인하기 위하여 각 세포주에 해당하는 GAPDH에 대한 RT-PCR을 실시한 결과, virus에 감염된 세포뿐만 아니라 virus에 감염되지 않은 세포에서도 유전자의 전사가 확인되었다. 각각의 세포 배양액과 세포에서 분리한 단백질을 이용하여 Western blot을 실시한 결과, virus 감염을 통하여 hGH 유전자가 전이된 세포에서는 hGH의 발현을 확인할 수 있었으며 virus에 감염되지 않은 세포에서는 hGH의 발현이 나타나지 않았다. CHO 세포에 비해 CEF 세포에서 hGH의 발현이 강하게 나타났으며 두 세포주 모두 세포에서 분리한 경우보다 세포 배양액으로 분비된 hGH의 양이 더 많은 것으로 확인되었다. 이는 hGH가 세포 내에서 생산된 후 세포 밖으로 분비되었음을 의미한다. hGH의 정량을 위하여 각 세포의 배양액을 수확하고 ELISA를 실시한 결과, Western blot 에서 비교적 높은 발현을 보인 CEF-LNC-hGHW 세포에서 5647.5 ng/㎖로 가장 높게 정량되었으며, CHO-LNC-hGHW 세포에서는 575.5 ng/㎖로 비교적 낮게 발현하는 것으로 나타났다. 각각의 세포주에 대한 대조군으로 사용한 비감염성 세포에서는 hGH의 값이 거의 나타나지 않았다. 이러한 결과는 virus의 감염을 통하여 세포의 genome 내로 전이된 hGH 유전자의 발현이 정상적으로 일어나고 있으며, 세포에서 생산된 hGH 단백질이 세포 밖으로 분비되고 있음을 의미한다. 재조합 hGH의 생물학적 활성은 CEF-LNChGHW와 CHO-LNChGHW 세포주로 부터 수확한 배양액을 ELISA로 정량한 후, 각 세포주에서 발현된 hGH의 농도에 따른 Nb2-11 세포의 증식 정도로 MTT 방법으로 측정하였다. 각 세포주에서 수확한 hGH의 농도가 증가할수록 흡광도 값이 증가하였으며, 대장균에서 생산된 standard recombinant hGH와 비교하였을때 생물학적 활성에 큰 차이를 나타내지 않았다.
2. hEPO 유전자가 발현되는 virus vector system의 in vitro 검정
hEPO 유전자가 전이된 표적세포에서의 RT-PCR 분석을 실시한 결과, virus가 감염된 세포주에서는 hEPO 유전자와 Neomycin 저항성 유전자의 전사가 확인되었으며 감염되지 않은 대조구 세포들에서는 확인되지 않았다. CEF-LNC-hEPOW와 CHO-LNC-hEPOW 세포를 48시간 배양한후, 각 배양액에 포함된 hEPO의 정량적 분석을 ELISA 방법으로 실시한 결과, virus가 감염되지 않은 대조구 세포에서는 측정값이 거의 나타나지 않은 데 비해서, virus가 감염된 세포의 배양액, 즉 CEF-LNC-hEPOW에서는 1673.6 IU/㎖의 농도를 나타내었고 CHO-LNC-hEPOW에서는 188.8 IU/㎖의 농도로 측정되었다. 이는 세포에서 생산된 hEPO 단백질이 세포 밖으로 분비되고 있음을 의미한다. 특히 CEF-LNC-hEPOW 세포에서 매우 강한 발현을 나타내었다. 재조합 hEPO의 생물학적 활성은 CEF-LNC-hEPOW와 CHO-LNC-hEPOW 세포주로부터 수확한 배양액을 ELISA 방법으로 정량한 후, 각 세포주에서 발현된 hEPO의 농도에 따른 TF-1 세포의 증식 정도를 MTT 방법으로 측정하였다. CEF, CHO 세포주에서 수확한 hEPO의 농도가 증가할수록 흡광도 값이 증가하였으며, 각 세포에서 생산된 재조합 hEPO는 상업적으로 시판되고 있는 재조합 EPO에 비해서 월등히 높은 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 특히 CEF 세포에서 생산된 재조합 hEPO의 생물학적 활성이 가장 높게 나타났다.
3. hGH 유전자가 발현되는 형질전환 닭의 생산
LNC-hGHW virus vector가 도입된 형질전환 닭 생산 실험은 3차에 거쳐서 진행되었으며, 부화한 병아리는 한 마리뿐이며 이 개체는 형질전환이 되지 않은 개체인 것으로 확인되었다. 따라서 이 후 형질전환 닭 생산 실험은 hEPO 유전자를 전이한 형질전환 닭을 생산하는 데에 집중하기로 하였다.
4. hEPO 유전자가 발현되는 형질전환 닭의 생산
생산한 LNC-hEPOW virus로부터 viral RNA를 분리하여 RT-PCR을 실시하였다. 그 결과, hEPO 유전자와 Neomycin 저항성 유전자의 전이가 확인되었으며, 각각의 농축 후 virus의 감염가를 측정하였더니 1 × 10⁹ CFU/㎖ 이상의 수치를 나타내었다. 고농도의 LNC-hEPOW virus를 유정란의 배반엽 층에 미세주입하여 형질전환 닭을 생산하는 실험은 모두 4차에 걸쳐 실시되었으며 현재까지 27마리의 형질전환 닭을 생산하였다. 이 가운데 수컷은 9마리이고 18마리는 암컷으로 확인되었다.
LNOv23-hEPOW virus vector system을 이용하여 생산한 virus로부터 viral RNA를 분리하여 RT-PCR을 실시한 결과, hEPO 유전자와 Neomycin 저항성 유전자의 전이가 확인되었으며, 각각의 농축 후 virus의 감염가를 측정하였더니 LNC-hEPOW와 마찬가지로 1 × 10⁹ CFU/㎖ 이상인 것으로 확인되었다. LNOv23-hEPOW virus vector system을 이용한 형질전환 닭을 생산하는 실험은 현재까지 12차에 걸쳐 실시되었으며 91마리의 형질전환 닭을 생산하였다. 이 가운데 수컷은 60마리이고 나머지 31마리는 암컷이다. 이 개체들도 LNC-hEPOW 형질전환 개체와 마찬가지로 성성숙이 완료되는 대로 G1 생산을 시도하고자 하였다. 5차 실험군에서는 162개의 유정란에 virus를 미세주입하였으며, 44마리가 부화하였다. 부화한 44마리 중에서 유전자의 도입이 확인된 개체는 42마리인데 주목할 만한 사항은 이 가운데 18마리만이 hEPO 유전자와 Neomycin 저항성 유전자, 그리고 ψ 서열의 전이가 모두 확인되었으며 나머지 26마리에서는 Neomycin 저항성 유전자와 ψ 서열의 전이만 확인되고 hEPO 유전자의 전이는 확인되지 않았다. 이러한 현상은 개체에 도입된 virus vector의 일부 서열이 deletion되었을 가능성을 보여주는 것이다. Germline transmission의 가능성을 확인을 위하여 성성숙이 완료된 형질전환 수컷개체에서 채취한 정자의 DNA를 분리하여 PCR 분석을 실시하였다. 그 결과, 9차 실험군에서 생산한 형질전환 수컷의 sperm에서 외래 유전자의 전이가 확인되었으며, wild type의 암컷과 교미하여 G1 세대를 생산하였다.
5. 형질전환 닭의 다양한 생산 방법 구축 및 효율적인 생산 방법 선별
가. 외래 유전자가 도입된 SSC를 이용한 형질전환 닭의 생산
닭의 16.5일령 배아로부터 SSC를 분리하여 in vitro culture하는 방법을 구축하고자 하였다. 약 3일 후부터 colony를 서서히 형성하기 시작하였으며, 10일 정도 경과 후부터는 육안으로 확인되는 크기의 colony를 형성하였다. 또한 분리 배양한 SSC의 분화전능성 유무를 확인하기 위하여 조직면역화학적 염색을 실시하였으며 SSC의 배양을 광학현미경 하에서 관찰하여 형태학적 특징을 확인하고자 하였다. 그 결과, SSC의 형태학적 특징으로 알려진 colony 형성은 배양을 시작한 후 7일 경과 후부터 관찰되었으며, stem cell 계열의 세포에 특징적인 염색 반응을 보이는 SSEA-1과 EMA-1 antibody를 이용한 조직면역화학적 염색을 실시하였더니 colony가 붉게 염색되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 분리 배양한 SSC는 stem cell의 특징을 가지고 있는 것으로 판단되었다. SSC에서 RNA를 분리하여 RT-PCR을 실시한 결과, 대조구로 사용한 CEF 세포에서는 나타나지 않는 반면에 SSC에서는 닭의 stem cell에 특징적으로 나타나는 cGATA4, cLin28, cSox2, cNanog, 그리고 cPouV 유전자의 발현이 확인되었다. SSC 분리 초기 단계에 LNRGW virus에 감염된 SSC는 지속적인 배양에서도 EGFP 유전자의 발현이 계속 유지되는 것을 확인하였으며 이는 retrovirus vector system을 이용하여 in vitro 상에서 SSC로의 외래 유전자 전이가 효율적으로 이루어질 수 있음을 의미한다. Virus에 감염된 SSC의 RNA를 분리하여 RT-PCR을 실시하여 외래 유전자의 전이 여부를 확인한 결과, Neomycin 저항성 유전자, EGFP, WPRE 서열이 virus에 감염되지 않은 SSC에서는 확인되지 않고 virus에 감염된 SSC에서만 나타났다. 외래 유전자가 전이된 SSC를 수탉의 정소 내로 주입하기 전에, 정소 내의 분화가 진행되는 정조세포들을 제거하기 위하여 busulfan을 2회에 걸쳐서 처리하였다. Busulfan 처리 후 각 개체의 정소가 대조구에 비해 1/10배로 위축되었음을 확인하였고, 각 정소를 고정하여 염색한 후 조직 절편을 제작하여 현미경 하에서 관찰한 결과, 정세관 내의 세포 중에서 정원세포를 제외한 분화 발생 중인 대부분의 세포들이 사멸된 것을 확인할 수 있었다. 외래유전자가 전이된 SSC는 외과적인 수술을 통하여 약 30마리의 수탉의 정소 내로 주입하였다. 각 개체는 약 10주간 사양한 후, sperm으로부터 genomic DNA PCR을 실시하였다. 현재까지 유전자의 전이가 확인된 개체는 없는 상태이며 일부 개체에서는 정액을 채취할 수 없었다.
나. Electroporation 방법을 이용한 GFP 형질전환 닭의 생산
Electroporation을 이용한 형질전환 닭의 생산에 사용할 vector인 pPB-EGFP-Puro를 닭에 적용하기 전 예비실험으로 in vitro 검정을 실시하였다. pPB-EGFP-Puro vector는 293 세포에 transfection한 후, 형광현미경 하에서 EGFP 유전자의 발현 여부를 확인하고자 하였다. 그 결과, vector가 전이된 세포에서 EGFP 유전자의 발현으로 인한 형광이 관찰되었다. 외래 유전자의 발현이 확인된 본 vector를 electroporation 방법으로 sperm에 전이시켰다. 유전자가 전이된 sperm은 암탉에 인공수정하여 유정란의 산란을 유도하였다. 산란된 유정란을 부화시켜서 자손을 확보한 후 genomic DNA PCR 방법으로 외래 유전자의 전이 여부를 확인하고자 하였다.
다. REMI-SMGT 방법을 이용한 GFP 형질전환 닭의 생산
REMI-SMGT 방법을 이용한 형질전환 닭의 생산 연구는 현재까지 3회에 걸쳐 진행하였으며 교미한 암컷에서 산란된 유정란의 부화율과 형질전환 여부를 관찰하였다. REMI-SMGT 실험에 사용한 DNA 양이 적을수록 병아리의 부화율이 높게 나타났다. 이러한 현상은 정자와 혼합되는 vector DNA가 cytotoxic한 영향을 가지고 있음을 의미한다. 실제적으로 in vitro에서 정액과 DNA를 혼합하여 현미경 하에서 관찰해 보면 정자의 운동성이 급격히 저하되는 현상이 관찰되었다. 부화한 병아리를 대상으로 외래 유전자의 전이 여부를 확인하기 위하여 형광 현미경하에서 각 병아리를 관찰하였으나 현재까지 발현이 확인된 개체는 없었다.

Abstract ▼

In this study, we tried to generate transgenic chickens to obtain egg white containing pharmaceuticals such as hEPO or hGH. To accomplish this object, we first prepared the corresponding gene encoding hEPO or hGH, followed by confirmation of biological activity in vitro. The confirmed genes were put

In this study, we tried to generate transgenic chickens to obtain egg white containing pharmaceuticals such as hEPO or hGH. To accomplish this object, we first prepared the corresponding gene encoding hEPO or hGH, followed by confirmation of biological activity in vitro. The confirmed genes were put under the control of ovalbumin promoter with the purpose of oviduct-specific expression, which might alleviate physiological disturbance due to the constitutive expression of an exogenous gene. Using the oviduct-specific expression vector system, we successfully produced G0 transgenic chickens. After PCR analysis of the founder animal sperm, we crossed PCR - positive rooster with non-transgenic hen, and finally were able to generate non-mosaic G1 transgenics carrying hEPO transgene in the genome.
In addition to the work aforementioned, we also tried to develop new technology which might enhance the success rate of transgenic chicken production focusing on gene transfer method and target cell: Firstly, we constructed spermatogonial stem cell (SSC) carrying foreign gene after retrovirus vector-mediated transformation. By injecting the transformed SSC into the atrophied testis treated with busulfan, we tested whether the transgenic chicken progeny could be produced after mating. Secondary, we also tried sperm-mediated transgenesis following the sequential steps; Gene transfer to sperm cells by Restriction Enzyme Mediated Integration-Sperm mediated gene transfer (REMI-SMGT), and artificial insemination of the hens with the transformed sperm.
We are strongly convinced that the results obtained from this study not only increase significantly the productivity of bio-pharmaceuticals from the transgenic chickens, but also could be directly applied to the transgenesis of other species of animal.