보고서 정보
주관연구기관 |
순창장류(주) |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2015-01 |
과제시작연도 |
2012 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 |
TRKO201500011159 |
과제고유번호 |
1545005810 |
사업명 |
고부가가치식품기술개발 |
DB 구축일자 |
2015-07-18
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201500011159 |
초록
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Ⅳ. 연구개발결과
1. 볏짚 유래 Starter culture를 이용한 청국장, 된장 및 간장 발효·숙성 공정확립 및 시제품 생산, 상품화
가. RiBS1 적용 청국장, 메주, 된장 및 간장 발효공정 확립
(1) RiBS1 적용 청국장 발효공정 확립
B. cereus만이 특이적으로 제거된 볏짚 유래 starter culture인 RiBS1을 이용하여 청국장의 제조한 후 기존 청국장 단발효와 발효패턴 비교 분석을 통하여 발효조건을 확립하였다. 풍미와 위생성이 동시에 요구되는 청국장의 제조를 위해 개발된 start
Ⅳ. 연구개발결과
1. 볏짚 유래 Starter culture를 이용한 청국장, 된장 및 간장 발효·숙성 공정확립 및 시제품 생산, 상품화
가. RiBS1 적용 청국장, 메주, 된장 및 간장 발효공정 확립
(1) RiBS1 적용 청국장 발효공정 확립
B. cereus만이 특이적으로 제거된 볏짚 유래 starter culture인 RiBS1을 이용하여 청국장의 제조한 후 기존 청국장 단발효와 발효패턴 비교 분석을 통하여 발효조건을 확립하였다. 풍미와 위생성이 동시에 요구되는 청국장의 제조를 위해 개발된 starter culture의 발효온도 및 접종량을 달리하여 차이가 있는지 알아보았다. 기존 청국장의 발효 온도는 40℃로 Bacillus속이 가장 잘 자랄 수 있는 환경이며, 여기에 50℃로 온도 변화를 주어 고온에서 생육 가능한 균들만 자랄 수 있도록 환경 조건을 제시하였고, 기존의 양인 0.1%에서 1%로 10배 변화를 주었을 때 관능적인 면에서 긍정적인 변화를 미칠 것으로 예상하여 조건을 동시에 진행하였다. 또한, 개발 starter culture와 본사에서 기존의 사용하고 있는 Bacillus licheniformis SRCM0100027를 혼합하여 불확실한 면을 보완하도록 하여 대조군을 포함한 총 9가지 조건으로 실험을 하였다. 실험결과, 온도 별로 유의적 차이가 있었으며, 접종량은 차이를 보이지 않았다. 특히 발효온도 40℃보다 50℃로 발효한 청국장에서 관능적으로 양호한 판정을 얻었으며, 제2협동의 관능평가를 통해 선정한 발효온도 50℃, 발효시간 48hr, RiBS1만을 0.1% 접종한 청국장과 발효온도 50℃, 발효시간 24hr, RiBS1과 Bacillus licheniformis SRCM0100027를 혼합하여 0.1% 접종한 청국장을 시제품으로 제작하여 묘사분석 및 기호도 조사를 실시하였다.
(2) RiBS1 적용 메주 발효공정 확립
개발 starter culture인 RIBS1을 콩에 적용했을 때 접종량 및 접종온도가 발효기간에 따라 어떠한 특성이 나타나는지 알아보고자 기존 본사 접종량인 0.05%를 기준으로 2배, 3배 증가한 0.1%, 0.15%로 접종량을 다르게 하였으며 기본 본사 접종온도인 60℃를 기준으로 상하로 두어 50℃, 60℃, 70℃로 실시한 결과, 전체적으로 접종량 별로 큰 유의적 차이는 없는 것으로 나타났으며 접종온도는 기존 본사 대조군과 70℃로 접종한 RiBS1, 그리고 50℃로 접종한 RiBS1과 60℃로 접종한 RiBS1이 비슷한 경향을 보였다. 이의 결과에서 RiBS1의 접종온도별 차이가 있음을 알아내어 이와 더불어 RiBS1에 Aspergillus oryzae를 혼합 하여 접종온도를 다르게 함으로써 발효기간 별 차이가 있는지 알아보았다. 실험 결과 기존 본사 대조군과 비슷한 발효 패턴을 보이면서, 메주의 후 발효가 일어나지 않는 범위의 높은 protease활성과 아미노태 질소 함량이 높은 60℃의 접종온도를 선정하여 사각메주에 적용하였다. 메주는 본사의 기존 병형복발효 방법인 Bacillus licheniformis SRCM0100027과 Aspergillus oryzae를 사용하고, 실험군은 RiBS1만 접종한 메주(R), RiBS1과 Aspergillus oryzae를 접종한 메주(RA), RiBS1과 Bacillus licheniformis SRCM0100027 및 Aspergillus oryzae를 접종한 메주 (RBA)를 제조하여 실험했으며, 균의 접종온도는 앞의 실험에서 선정된 60℃로 하였다.
(3) RiBS1 메주 이용 된장 및 간장 숙성 연구
RiBS1을 적용한 메주를 25% 염수에 침지한 후 된장과 간장을 제조하고 숙성하여 품질특성을 살펴보았으며 된장의 경우 가장 큰 유의적 차이를 보이는 분석항목은 아미노태질소함량으로 RiBS1과 Bacillus licheniformis SRCM0100027 및 Aspergillus oryzae를 접종한 메주(RBA)를 이용한 된장이 474.6 mg%로 가장 높게 나타났으며 이는 기존 된장보다 높은 결과를 보였다. 또한 간장의 경우도 RBA가 기존 간장과 비슷한 결과를 보였으며, 최종 숙성 기간에서 기존과 Brix, 아미노태질소 함량 및 총질소 함량이 높은 결과를 나타내었다.
나. ORiBS1 적용 청국장, 메주, 된장 및 간장 품질변화 연구
(1) ORiBS1 적용 청국장 품질 변화 연구
B. cereus만이 특이적으로 제거된 유기농 볏짚 유래 starter culture인 ORiBS1을 이용하여 RiBS1청국장과 마찬가지로 기존 본사 대조군을 포함한 총 9가지 조건으로 실험을 하였으며, 실험 결과 발효온도별 뚜렷한 차이를 나타내었다. 특히 발효온도 50℃로 발효한 청국장에서 장류 품질의 중요한 척도인 Protease activity, pH 및 아미노태 질소 함량에서 높은 결과를 보였으며 관능적으로도 양호한 판정을 얻었다. 제2협동의 관능평가를 통해 선정한 발효온도 50℃, 발효시간 48hr, ORiBS1와 Bacillus licheniformis SRCM0100027를 혼합하여 0.1% 접종한 청국장과 발효온도 50℃, 발효시간 48hr, ORiBS1만을 1% 접종한 청국장을 제작하여 RiBS1 청국장과 관능 분석 차이를 비교하였다.
(2) ORiBS1 적용 메주 품질 변화 연구
메주는 본사의 기존 병형복발효 방법인 Bacillus licheniformis SRCM0100027과 Aspergillus oryzae를 사용하고, 실험군은 ORiBS1만 접종한 메주(OR), ORiBS1과 Aspergillus oryzae를 접종한 메주(ORA), ORiBS1과 Bacillus licheniformis SRCM0100027 및 Aspergillus oryzae를 접종한 메주(ORBA)를 제조하여 실험했으며, 균의 접종온도는 RIBS1 메주 연구에서 선정된 60℃로 동일하게 하였다.
(3) ORiBS1 메주 이용 된장 및 간장 숙성 연구
ORiBS1을 적용한 메주를 25% 염수에 침지한 후 된장과 간장을 제조하고 숙성하여 품질특성을 살펴보았으며 ORiBS1만 접종한 메주를 이용한 된장, 간장을 제외하고 비슷한 경향을 나타내었다.
다. 개발 제품 상품화 추진
(1) RiBS1 적용 청국장, 된장 및 간장 묘사분석 및 기호도 조사
제2협동에서 자체 관능평가 후 가장 선호도가 좋았던 RiBS1적용 청국장 2종과 기존 본사 청국장, 전국적으로 시판 중인 청국장 7종에 대해 묘사분석을 이용하여 각각의 관능적 특성을 분석하고 20대-50대 소비자를 대상으로 소비자 조사를 실시하여 청국장의 관능적 기호 유도인자를 분석하였으며 아울러 청국장의 반복 섭취 후 기호도 변화를 관찰하였다. 전체적으로 RiBS1적용 청국장의 경우 관능적 특성이 약하게 표현되었으며, 또한 소비자 기호도가 다른 시료들에 비해 두드러지는 특성이 나타나지 않았으나 반복적으로 소비자 조사를 진행한 결과 기간에 따라 RiBS1적용 청국장에 대한 기호도가 눈에 띄게 증가한 것으로 나타나 긍정적인 평가를 얻었다. 된장, 간장도 마찬가지로 묘사분석 및 기호도 조사를 실시한 결과 RiBS1적용 된장, 간장은 전국적으로 시판 중인 재래식 된장과 관능특성에서 유의적인 차이가 있음을 나타내었으며 전반적인 기호도도 양호했음을 알 수 있었다. 특히 RiBS1만을 적용한 된장, 간장 보다 Bacillus licheniformis SRCM0100027 및 Aspergillus oryzae를 함께 적용한 된장, 간장에서 긍정적인 결과를 얻을 수 있었다.
(2) RiBS1과 ORiBS1적용 청국장 관능특성 비교 분석
제2협동에서 자체 관능평가 후 가장 선호도가 좋았던 RiBS1 적용 청국장 2종과 ORiBS1 적용 청국장 2종의 관능특성 차이를 비교하기 위한 묘사분석 및 기호도 조사를 실시하였다. 실험 결과 ‘진한 정도’, ‘탁한 정도’, ‘쓴맛’, ‘전반 맛 강도’, 풋콩/콩 비린 향미‘, ’걸쭉한 정도‘에서 통계적으로 유의한 차이가 있음을 보였으며 전반 기호도는 OR > R+B > R > OR+B 순으로 나타났다.
(3) 소비자 조사 및 상품화 방안 마련
소비자 트렌드와 개발제품의 상품화 가능성을 알아보기 위해 청국장에 관한 설문조사를 실시하였으며, 기술개발 청국장 및 된장, 간장을 상품화하기 위한 판매 전략을 수립하고 라벨 제작 및 품목제조보고서 신고를 완료하였다.
2. 볏짚 유래 B. cereus free starter culture의 개발 및 scale up
가. RiBS1 연구관련 결과
(1) 다양한 양(0.1, 0.5, 1.0L)의 콩갈은물(GB)배지에 RiBS1을 다양한 농도(0.1, 1.0% innoculum)로 처리한 후 배양한 결과 총균수와 미생물 군집(DGGE)이 서로 유사함을 확인
(2) RiBS1을 이용한 메주의 microflora 분석결과 모든 샘플들에서 B. aerius와 B. licheniformis가 주요한 세균이 였고, 발효기간에 의한 차이도 미미하였음
(3) RiBS1을 이용한 된장의 microflora 분석 결과 모든 샘플에서 Bacillus가 주요세균이었고 특히 RiBS1를 첨가한 처리군들에서 많은 종류의 세균이 검출됨
(4) RiBS1을 이용한 간장의 microflora 분석 결과 대부분의 처리군들에서 Tetragenococcus halophilus가 주요균으로 확인되었고, 숙성기간에 따른 군집 변화가 있었으나, 일정한 패턴을 보이지는 않음
나. ORiBS1 연구관련 결과
(1) 유기농 볏짚 유래 ORiBS1을 개발하고, ORiBS1이 B. cereus-free임을 확인
(2) Passage에 따른 ORiBS1의 microflora 분석 결과, P3부터 microflora가 안정화됨을 확인
(3) 다양한 양(0.1, 0.5, 1.0L)의 콩갈은물(GB)배지에 ORiBS1을 다양한 농도(0.1, 1.0% innoculum)로 처리한 후 배양한 결과 총균수와 미생물 군집(DGGE)이 서로 유사함을 확인
(4) ORiBS1을 이용한 메주의 microflora 분석결과 모든 샘플들에서 발효초기 Pediococcus 또는 E. coli가 많은 비중을 차지하였으나 발효 후기로 갈수록, Enterococcus가 주요 세균으로 분석됨.
(5) ORiBS1을 이용한 된장의 microflora 분석 결과 발효 초기 세균군들은 샘플들별로 차이를 보였으나, 발효 후 반기에는 모든 샘플에서 Tetragenococcus halophilus이 주요 세균으로 분석됨
(6) ORiBS1을 이용한 간장의 microflora 분석 결과 대부분의 처리군들에서 발효후기 Tetragenococcus halophilus 또는 E. coli가 주요세균으로 분석됨
다. B. cereus를 사멸시키는 박테리오파지의 분리 및 특성분석
3. 위해미생물 및 제품품질특성분석과 개발된 B. cereus free starter의 장기보존 기술 개발
RIBS1의 starter culture의 분석 결과, B. cereus 포함한 Salmonella spp., E. coli, Stap. aureus, Cl. perfringenes 항목 모두에서 음성의 결과를 보였다. RIBS1의 starter로 제조한 콩알메주의 유리당 함량 중 fructose는 접종 온도가 60℃ 일 때 시간이 지날수록 증가하는 경향을 보였고, glucose와 maltose는 전반적으로 발효가 진행 될수록 증가하는 경향을 보였다. 반면, sucrose는 발효 초기에 생산이 되었다가 발효가 진행될수록 감소하는 경향을 보였다. RIBS1의 starter로 제조한 청국장의 유리당 중 fructose의 경우 전반적으로 발효초기에 생성되었다가 발효시간이 경과할수록 줄어드는 경향을 보였고, glucose는 배양 온도가 50℃인 실험구들은 발효시간이 경과할수록 급격하게 증가하는 경향을 보였다. Maltose는 전반적으로 발효 48시간까지 증가하다 그 이후에 감소하는 경향이었다. RIBS1의 starter로 제조한 사각메주의 fructose는 전체적으로 발효일수가 증가할수록 감소하는 경향을 보였고, glucose는 발효 초기에 증가하다 발효9일 이후에 급격하게 감소하는 경향을 보였다. Sucrose와 maltose는 발효 중 증가하는 경향을 보였다. RIBS1의 starter로 제조한 콩알메주의 유기산 중 citric acid와 succinic acid는 발효기간이 경과할수록 증가하는 경향을 나타냈다. 반면 acetic acid는 발효시간이 경과함에 따라 감소하는 결과를 나타내었다. RIBS1의 starter로 제조한 청국장 중의 발효온도가 50℃ 이며 RIBS1을 0.1% 접종한 실험구에서는 유리아미노산 중 taurine이 다른 실험구에 비해 2배 이상 높은 결과 값을 보였고, 사각메주의 경우 모든 실험구에서 taurine의 함량이 가장 높은 것으로 나타났다. β-amylase 활성은 콩알메주와 청국장의 경우 발효시간이 경과할수록 증가하는 경향을 나타내었다. 청국장의 경우 가장 높은 수치를 보인 실험구의 β-amylase 활성은 1,881×104 unit으로 콩알메주 및 사각메주에 비해서 높은 β-amylase 활성을 보였다. 청국장 36개 실험구에 대하여 16명의 패널을 대상으로 관능검사를 실시한 결과는 sample 2인 발효온도 50℃, 24h 0.1% R+B와 sample 4인 발효온도 50℃, 48h 0.1% R의 실험구에서 가장 높은 기호도를 나타내었다. RIBS1의 starter로 제조한 콩알메주 및 사각메주의 청국장 실험구의 위해미생물을 분석한 결과 모두 음성의 결과를 나타내었다. 바이오제닉 아민의 경우, histamine은 모든 실험구에서 검출이 되었다. 청국장은 대조구의 39.96 mg/L에 비해 실험구에서 15.42 mg/L가 검출되어 낮은 수치를 나타내었다. 사각메주의 경우, 대조구에 비해 RIBS1만을 이용한 실험구에서는 낮은 수치를 보였지만 RIBS1과 A. oryzae를 혼합한 실험구에서 가장 높게 나타났다. Tyramine은 사각메주 RA, RBA 실험구와 청국장의 발효 24h 대조구에서 미량 검출되었다. Cadaverine은 모든 실험구에서 검출되지 않았다. 콩알메주 및 사각메주, 청국장 실험구의 총아플라톡신을 분석한 결과 모두 불검출의 결과를 나타내었다. RIBS1 starter를 이용하여 개발한 된장의 각 실험구별 숙성 완료인 18주차의 유리당 함량은 maltose는 0∼557 mg/L, glucose는 0∼111 mg/L로 검출되었고, fructose는 904∼2,553 mg/L로 유리당 중 가장 많은 함량을 보였다. RIBS1 starter를 이용하여 개발한 간장의 유리당 함량 중 maltose와 fructose의 경우 숙성초기에 각각 333∼667 mg/L, 2,453∼4521 mg/L로 높은 함량을 나타내었지만, 숙성이 진행 될수록 감소하는 경향을 보였다. Glucose는 숙성 18주차에 R 실험구와 RA에서 각각 14.7 mg/L, 73.8 mg/L 검출되었다. 된장의 유기산 중 citric acid의 경우 RA 실험구의 숙성 완료일에 가장 높은 3,044 mg/L 가 검출되었다. 이는 대조구인 BA 실험구의 1,336 mg/L의 2배 이상에 해당하는 수치이다. Succinic acid는 숙성 완료일에 213∼400 mg/L로 초기 값보다 낮은 값을 나타내었다. Lactic acid는 숙성 완료일에 11,745∼15,766 mg/L로 검출된 유기산의 함량 중 가장 높은 값을 나타내었다. Acetic aicd는 숙성 완료일에 증가하는 경향을 나타내었지만 숙성 초기의 873∼1,590mg/L보다 낮은 858∼1,145 mg/L 값을 나타내었다. 간장의 유기산은 전반적으로 숙성이 진행될수록 감소하는 경향을 보였다. Citric acid의 숙성완료일 함량은 637∼1,556 mg/L로 숙성이 진행될수록 급격하게 감소하였다. Succinic acid는 숙성 완료일에 134∼325 mg/L의 함량을 나타냈으며, lactic acid는 10,356∼14,410 mg/L로 된장과 유사하게 검출된 유기산중 가장 높은 값을 나타내었다 Acetic acid는 RA와 RBA 실험구의 경우 485 mg/L, 950 mg/L 값을 나타내었다. RIBS1 starter를 이용하여 개발한 된장의 β-amylase 활성은 대조구와 R 실험구는 숙성 초기에 비해 숙성 완료일에 증가된 경향을 보였고, RB와 RBA 실험구는 숙성 완료일에 숙성초기보다 다소 낮은 761 unit, 563 unit 이었다. 간장의 β-amylase 활성은 숙성 완료일 RB 실험구에서 827 unit으로 R 실험구 302 unit보다 약 2.7배 높은 값을 나타내었다. β-amylase 활성은 된장과 간장에서 모두 RB 실험구가 가장 높은 수치를 나타내었다. RIBS1 starter를 이용하여 개발한 된장 및 간장의 바이오제닉아민 분석결과 된장의 histamine은 349.8∼469.0 mg/L, 간장의 hitamine은 284.3∼309.9 mg/L가 검출되었고, Tyramine의 경우 된장은 188.2~204.8 mg/L, 간장은 149.0~156.3 mg/L가 검출되었다. 병원성미생물을 분석한 결과는 된장의 경우 Salmonella spp., E. coli, Stap. aureus, Cl. perfringenes 등의 병원성미생물은 모두 음성의 결과를 나타내었고, R 실험구를 제외한 대조구, RA, RBA 실험구에는 B. cereus가 검출되었지만 식약처 장류 기준인 104 이하의 값으로 검출되었다. 간장의 경우 B. cereus를 포함한 모든 병원성미생물은 검출 되지 않았다. RIBS1 starter를 이용하여 개발한 된장 및 간장의 총아플라톡신을 분석한 결과 모든 실험구에서 0.0 ㎍/kg 또는 불검출로 분석되었다. ORIBS starter의 병원성미생물을 분석한 결과 RIBS1과 동일하게 모든 병원성미생물 항목에서 음성의 결과를 나타내었다. ORIBS starter를 이용하여 개발한 메주의 β-amylase 활성은 OR 실험구 462 unit, ORA 실험구 541 unit, ORBA 숙성 완료일에는 611 unit으로 분석되었다. ORIBS starter를 이용하여 개발한 메주의 숙성 12주차의 바이오제닉아민을 분석한 결과 hitamine은 ORA 실험구에서 4.0 mg/L로 검출된 것을 제외하고는 대조구, OR, ORBA 실험구에서는 검출되지 않았다. ORIBS starter를 이용하여 개발한 메주의 병원성미생물을 분석한 결과 모든 실험구 및 병원성미생물에서 불검출 및 음성의 결과를 나타내었다. 메주의 총아플라톡신을 분석한 결과는 대조구의 경우 불검출로 분석되었고, OR 실험구는 0.9 ㎍/kg, ORA 실험구는 0.0 ㎍/kg, ORBA 실험구는 0.1 ㎍/kg의 함량 결과를 나타내었다. ORIBS starter를 이용하여 개발한 청국장의 유리당 함량을 분석한 결과 maltose의 경우, 발효 72시간 경과 후 40℃0.1% OR+B 실험구에서 5,158 mg/L로 가장 높은 함량을 나타내었고, 이는 발효 72시간 경과 후 50℃0.1% OR+B 실험구인 307 mg/L에 비해 약 16배 이상 높은 함량이었다. Fructose와 glucose는 발효가 진행될수록 증가하는 경향을 보였다. ORIBS stater로 제조한 청국장의 유기산 중 lactic acid의 경우 접종온도가 40℃ 처리구는 발효시간이 경과할수록 증가하는 경향을 보였고, 50℃ 처리구는 발효시간이 경과할수록 감소하는 경향을 보였다. Succinic acid는 접종온도가 50℃ 경우, 발효 48시간 경과하였을 때 265∼532 mg/L, 72시간 경과 후에는 594∼914 mg/L로 증가하였다. 40℃의 경우 발효 24시간과 발효 72시간의 함량이 유사하였다. ORIBS starter를 이용하여 개발한 청국장의 바이오제닉아민 중 histamine의 경우 50℃ OR+B 0.5% 실험구에서는 42.1 mg/L, 50℃ OR 1% 실험구에서는 21.2 mg/L의 함량이 검출되었다. ORIBS starter를 이용하여 개발한 청국장의 병원성미생물을 분석한 결과 모든 실험구 및 병원성미생물에서 불검출 및 음성의 결과를 나타내었다. 청국장의 총아플라톡신을 분석한 불검출과 0.0 ㎍/kg의 수치를 나타내었다. ORIBS starter를 이용하여 개발한 된장의 전체적인 유리당 함량은 숙성이 진행될수록 감소하는 경향을 보였다. Maltose는 숙성 10주차의 OR실험구에서 가장 높은 436 mg/L, 대조구와 ORBA 실험구의 값은 각각 108 mg/L 와 111 mg/L가 검출되었다. Glucose의 경우 ORA 실험구에서 1,477 mg/L, fructose의 경우 OR 과 ORA 실험구에서 7630 mg/L 와 7366 mg/L가 각각 검출되었다. 간장의 유리당 함량은 된장의 함량과 유사하게 숙성이 진행될수록 감소하는 경향을 보였다. 된장의 lactic aicd는 숙성이 진행될수록 증가하는 경향을 보였으며 대조구 11,788 mg/L, OR 10,872 mg/L, ORA 8,490 mg/L, 9,495 mg/L로 검출되었다. Acetic acid의 경우 ORA 실험구에서 1,433 mg/L 로 가장 높은 값을 나타내었다. 반면 Succinic acid는 모든 실험구에서 검출되지 않았다. 간장의 lactic acid의 경우 대조구를 제외한 실험구에서 숙성이 진행될수록 증가하는 경향을 보였으며 ORA 실험구에서 11,840 mg/L로 가장 높은 함량을 나타내었다. Succinic acid는 된장과 다르게 대조구의 숙성 완료일과 ORA 실험구의 숙성완료일에 검출되었으며, 각각 936mg/L, 3787 mg/L가 검출되었다. ORIBS starter를 이용하여 개발한 된장의 β-amylase 활성은 숙성 10주차의 대조구는 421unit으로 가장 높았고 다른 실험구는 340∼382 unit의 분포로 유사하였다. 간장은 OR 실험구에서 396 unit으로 다른 실험구에 비해 다소 높은 값을 나타내었다. ORIBS starter를 이용하여 개발한 된장의 바이오제닉 아민은 된장의 OR 실험구에서 histamine이 0.6 mg/L가 검출된 것을 제외하고, 된장 및 간장의 histamine은 모두 불검출 되었다. 병원성미생물 분석 결과, 된장과 간장의 각 실험구에서 Salmonella spp., E. coli, Stap. aureus, Cl. perfringenes 모두 음성의 결과를 나타내었다. 반면 B. cereus의 경우 된장의 OR 실험구와 ORA 실험구에서 각각 4.2×104, 3.1×104 CFU/mL 수준으로 검출되었고, 간장은 ORA 실험구에서 3.2×102 CFU/mL 수준으로 검출되었다. ORIBS starter를 이용하여 개발한 된장 및 간장의 총아플라톡신을 분석한 결과 모든 실험구에서 0.0 ㎍/kg과 불검출로 분석되었다.
Abstract
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Ⅲ.The result of Research and Development
1. Production of Prototype and Commercialization of Fermentation and Production Method of Cheonggukjang, Doenjang, and Soy Sauce Using Straw-Derived Starter Culture
A. Establishing Fermentation Process of Cheonggukjang, Doenjang, and Soy Sauce by Applyi
Ⅲ.The result of Research and Development
1. Production of Prototype and Commercialization of Fermentation and Production Method of Cheonggukjang, Doenjang, and Soy Sauce Using Straw-Derived Starter Culture
A. Establishing Fermentation Process of Cheonggukjang, Doenjang, and Soy Sauce by Applying RiBS1
(1) Establishing Fermentation Process of Cheonggukjang by Applying RiBS1
Cheonggukjang was made by using RiBS1, a starter culture derived from straw from which only B. cereus was specifically removed, and then, the fermentation conditions were established based on comparison with single-step fermentation and fermentation pattern of conventional Cheonggukjang. Fermentation temperature and seed volume of the starter culture, which was developed to make Cheonggukjang that satisfies both savor and hygiene, was varied to examine the difference. The fermentation temperature of conventional Cheonggukjang is 40℃, which is ideal for growth of Bacillus, and the temperature was changed to 50℃ so that only bacteria that can survive in high temperature could grow. The volume was changed from the conventional 0.1% to 1%, 10-fold increase, as it was expected to have a positive effect on the sensory aspect. Also, the proposed starter culture and the company’s conventional Bacillus licheniformis SRCM0100027 were mixed to reduce uncertainty and the test was carried out under nine conditions including the control group. The result showed that there was significant difference between different temperature settings but there was no difference in seed volume. Particularly, cheonggukjang that was fermented at 50℃ had more positive result in sensory test than that fermented at 40℃, and, Cheonggukjang(R) inoculated at 0.1% with only RiBS1, fermented at 50℃, the temperature selected based on the second cooperative sensory test, for 48 hours, and Cheonggukjang (R+B) inoculated at 0.1% with mixture of RiBS1 and Bacillus licheniformis SRCM0100027, fermented at 50℃ for 24hr were made as prototypes for descriptive analysis and preference survey.
(2) Establishing Fermentation Process of Meju by Applying RiBS1
In order to examine seed volume and inoculation temperature according to fermentation period, when the developed starter culture RIBS1 was applied to soybeans, based on the company’s standard seed volume 0.05%, seed volume was increased by twice and three times, 0.1%, 0.15%, and, based on the company’s standard inoculation 60℃, the temperature was varied to 50℃, 60℃, and 70℃. The result showed that there is no significant difference according to the seed volume, and, as for inoculation temperature, the company’s standard control group and RiBS1 inoculated at 70℃, and RiBS1 inoculated at 50℃ and that inoculated at 60℃ were similar. As difference in inoculation temperature of RiBS1 was found to have an effect, RiBS1 was mixed with Aspergillus oryzae to examine difference according to fermentation period, by changing inoculation temperature. The result showed that the fermentation pattern was similar to the company’s standard control group, and high protease activity that does not cause after-fermentation of Meju and inoculation temperature with high amino nitrogen content, 60℃, was selected and applied to square Meju. For Meju, the company’s standard fermentation method, Bacillus licheniformis SRCM0100027 and Aspergillus oryzae, was used, and, for the experimental group, Meju(R) for which only RiBS1 was inoculated, Meju(RA) for which RiBS1 and Aspergillus oryzae, and Meju(RBA) for which RiBS1, Bacillus licheniformis SRCM0100027, and Aspergillus oryzae was inoculated, were made for test, with the inoculation temperature set at 60℃.
(3) Study on Fermentation of Doenjang and Soy Sauce Using RiBS1 Meju
RiBS1-applied Meju was soaked in 25% salt water and Deonjang and Soy sauce was made and fermented before examining quality characteristics. In Doenjang, the most significant difference was fund in amino nitrogen content, which was the highest, 474.6 mg%, Meju(RBA) for which RiBS1, Bacillus licheniformis SRCM0100027, and Aspergillus oryzae, and the content was higher than conventional Doenjang. Also, in Soy sauce, RBA was similar to conventional Soy sauce, and, in the final fermentation period, brix, amino nitrogen content, and total nitrogen was high.
B. Study on Quality Change of Meju, Deonjang, and Soy Sauce after Application of ORiBS1
(1) Quality Change of ORiBS1-Applied Cheonggukjang
By using ORiBS1, a starter culture derived from organic straw from which only B. cereus was specifically removed, like with RiBS1 Cheonggukjang, the test was carried out under nine conditions including the company’s standard control group, and the result showed clear difference between different fermentation temperatures. Particularly, in Cheonggukjang fermented at 50℃, the protease activity, pH, and amino nitrogen content, which are important parameters of quality of traditional sauces, was high, and the sensory test result was positive as well. Cheonggukjang inoculated at 0.1% with mixture of ORiBS1 and Bacillus licheniformis SRCM0100027, fermented at 50℃, the temperature selected based on the second cooperative sensory test, for 48 hours, and Cheonggukjang (OR) inoculated at 0.1% with only ORiBS1, fermented at 50℃ for 24hr were made as prototypes and used for sensory analysis comparison with RiBS1 Cheonggukjang.
(2) Quality Change of ORiBS1-Applied Meju
For Meju, the company’s standard fermentation method, Bacillus licheniformis SRCM0100027 and Aspergillus oryzae, was used, and, for the experimental group, meju(OR) for which only ORiBS1 was inoculated, Meju(ORA) for which ORiBS1 and Aspergillus oryzae, and Meju(ORBA) for which ORiBS1, Bacillus licheniformis SRCM0100027, and Aspergillus oryzae was inoculated, were made for test, with the inoculation temperature set at 60℃ as in the RIBS1 Meju study.
(3) Study on Fermentation of Doenjang and Soy Sauce Using ORiBS1 Meju
ORiBS1-applied Meju was soaked in 25% salt water and Deonjang and Soy sauce was made and fermented before examining quality characteristics. They showed similar results except the Deonjang and soy sauce for which only ORiBS1 was inoculated.
C. Commercialization of the Developed Products
(1) Descriptive Analysis and Preference regarding RiBS1-Applied Cheonggukjang, Doenjang, and Soy Sauce
Sensory characteristics were analyzed by using descriptive analysis regarding two types of RiBS1-applied Cheonggukjang, which were most preferred in the second cooperative sensory test, the company’s Cheonggukjang product, and seven Cheonggukjang products that are available in South Korea, and a survey was conducted with consumers in their 20s to 50s to analyze sensory preference inducing factors of Cheonggukjang, and observe change of preference after repeated intake of Cheonggukjang. Overall, RiBS1-applied Cheonggukjang showed weak sensory characteristics and, although consumer preference was not stronger than other samples, repeated consumer survey led to positive feedback with remarkably increasing preference of RiBS1-applied Cheonggukjang. Also, in descriptive analysis and preference survey, significant difference in sensory characteristics was found between RiBS1-applied Deonjang and Soy sauce and traditional products available in the market, and the overall preference was positive. Particularly, more positive result was obtained in Doenjang and Soy sauce to which both Bacillus licheniformis SRCM0100027 and Aspergillus oryzae were applied rather than only RiBS1.
(2) Comparison of Sensory Characteristics between RiBS1- and ORiBS1-Applied Cheonggukjang
Descriptive analysis and preference survey was conducted in order to compare sensory characteristics of two types of RiBS1-applied Cheonggukjang and two types of ORiBS1-applied Cheonggukjang, which showed highest preference in the second cooperative sensory test. The test result showed statistically significant difference in ‘strength,’ muddiness,’ ‘bitterness’, ‘overall strength of taste’, ‘fishy taste of soybean‘, and ’thickness,’ with the overall preference strongest OR > R+B > R > OR+B in the order.
(3) Commercialization of the Developed Products
To examine consumer trend and possibility of commercializing the developed products, a survey was conducted regarding Cheonggukjang and product label and manufacturing items reports were completed and submitted to commercialize the developed Cheonggukjang, Doenjang, and Soy sauce.
2. Develop a Rice Straw-derived Bacillus cereus-free Starter Culture and scale up
Rice straw is well-known niche for collections of microorganisms which is the source for traditionally fermented soybean foods in Korea. However, it contains harmful microorganisms including Bacillus cereus together with beneficial microorganisms. In this study, we developed two Bacillus cereus free starter cultures (RiBS1 and ORiBS1) and optimized the condition for large scale preparation of RiBS. In addition, microflora of fermented foods (Meju, Doenjang and Ganjang) manufactured using RiBS were analyzed. First of all, microflora of RiBS1 and ORiBS1 were different. Secondly, microflora in the starter culture, Meju, Doenjang and Ganjang were significantly different each other. Thirdly, although RiBS-treated Jangryu tend to contain more diverse microflora, it was difficult to specify microflora in the RiBS-treated samples compare to the control (with B. licheniformis and Aspergillus oryzae). In conclusion, experimental data showing different microflora in different RiBS cultures and successful production of RiBS-added Jangryu products suggest that development of rice-straw-derived-B. cereus-free-starter-culture is a promising strategy to produce safe Jangryu product with qualities of Korean tradition.
3. Analysis of Harmful Microbes and Product Quality Characteristics and Development of Technology for Long-Term Preservation of B. cereus free starter
Analysis of starter culture for RIBS1 showed negative results for all of salmonella spp., E. coli, stap. aureus, Cl. perfringenes as well as B. cereus. In free sugar content of bean meju made with the RIBS1 starter, fructose increased over time at inoculation temperature of 60℃, while glucose and maltose increased overall as fermentation progressed. However, sucrose was produced in the early fermentation stage, but decreased as fermentation progressed. In free sugar content of cheonggukjang made with the RIBS1 starter, fructose was produced in the early fermentation stage and decreased as fermentation progressed, while glucose in experimental groups cultured at 50℃ rapidly increased as fermentation progressed. Overall, maltose increased until 48 hours of fermentation and then decreased. Fructose in square meju made with the RIBS1 starter decreased as fermentation progressed, while glucose increased in the early fermentation stage and rapidly decreased after 9 days of fermentation. Sucrose and maltose tended to increase during fermentation. In organic acid in bean meju made with the RIBS1 starter, citric acid and succinic acid increased as fermentation progressed. However, acetic acid decreased as fermentation progressed. In the experimental group in which cheongukjang made with the RIBS1 starter was fermented at 50℃ and RIBS1 was inoculated at 0.1%, taurine was as twice high as in other experimental groups, and, as for square meju, in all experimental groups, taurine content was the highest. β-amylase activity in bean meju and cheonggukjang increased as fermentation progressed. As for cheonggukjang, in an experimental group, the highest β-amylase activity was 1,881×104unit, which was higher than bean and square meju. A sensory test was conducted with 16 people regarding 36 cheonggukjang experimental groups, and the most preferred groups were Sample 2 (50℃, 24h 0.1% R+B) and Sample 4(50℃, 48h 0.1% R). Negative result was found in all harmful microbes of cheongukjang experimental groups of bean and square meju made with the RIBS1 starter. As for biogenic amine, histamine was found in all experimental groups. Cheonggukjang experimental group contained 15.42mg/L, lower than the control group, 39.96 mg/L. As for square meju, in comparison to the control group, the experimental group for which only RIBS1 was used showed a low content, but it was the highest in the experimental group for which RIBS1 and A. oryzae was mixed. A small amount of tyramine was found in the square meju RA and RBA groups and the 24h fermentation control group of cheonggukjang. Cadaverine was not found in any experimental group. Aflatoxin was not detected in all of the experimental groups of bean and square meju and cheonggukjang. Of free sugars of doenjang developed by using the RIBS1 starter, in the 18th week, 0∼557mg/L of maltose and 0∼111 mg/L of glutose was detected, and fructose showed the highest content among free sugars, 904∼2,553 mg/L. Of free sugars of soy sauce developed by using the RIBS1 starter, although maltose and fructose contents were high, 333∼667 mg/L and 2,453∼4521 mg/L, respectively, during the early fermentations stage, they declined as fermentation progressed. In the 18th week of fermentation, 14.7 mg/L and 73.8 mg/L of glucose was detected in the R and RA groups, respectively. Of organic acids of doenjang, the highest content of citric acid, 3,044 mg/L, was detected on the day of complete fermentation of the RA group. This was as twice high as that of the control group, BA, 1,336 mg/L. The succinic acid content was lower on the day of complete fermentation, 213∼400mg/L, than the initial content. Lactic acid was the highest among detected organic acids, 11,745∼15,766 mg/L, on the day of complete fermentation. Acetic acid increased on the day of complete fermentation, but was low, 858∼1,145 mg/L, in comparison to the early fermentation, 873∼1,590 mg/L. Organic acids of soy sauce decreased overall as fermentation progressed. Citric acid content rapidly decreased, to 637∼1,556 mg/L, on the day of complete fermentation. Succinic acid content on the day of complete fermentation was 134∼325mg/L, and lactic acid 10,356∼14,410 mg/L, the highest among organic acids detected similarly to doenjang. Acetic acid contents, in RA and RBA experimental groups, were 485 mg/L and 950 mg/L. In the control and R experimental group, β-amylase activity of doenjang developed by using RIBS1 starter increased on the day of complete fermentation in comparison to the early fermentation stage, and, in RB and RBA experimental group, it was slightly lower on the day of complete fermentation than the early fermentation stage, with 761unit and 563unit, respectively. In the RB experimental group, β-amylase activity in soy sauce was 827unit, on the day of complete fermentation, about 2.7 times higher than the R experimental group, 302 unit. The RB experimental group showed the highest β-amylase activity in both doenjang and soy sauce. In analysis of biogenic amine of doenjang and soy sauce developed by using RIBS1 starter, 349.8∼469.0 mg/L of histamine was detected in doenjang and 284.3∼309.9 mg/L in soy sauce, and , as for tyramine, 188.2~204.8 mg/L was detected in doenjang and 149.0~156.3 mg/L in soy sauce. In pathogenic microbe analysis, in doenjang, negative results were found in pathogenic microbes like salmonella spp., E. coli, stap. aureus, and Cl. perfringenes, and, B. cereus was found in the control group, and the RA, RBA experimental groups, except the R experimental group, but was below the standard of MFDS, 104. In soy sauce, none of the pathogenic microbes was detected. In doenjang and soy sauce developed by using the RIBS1 starter, no aflatoxin was found or detected in any of the experimental groups. Analysis of pathogenic microbes of the ORIBS starter showed, like in RIBS1, negative results in all of the pathogenic microbes. In meju developed by using the ORIBS starter, β-amylase activity was 462 units in the OR experimental group, 541 units in the ORA group, and 611 units on the day of complete fermentation of ORBA. In biogenic amine analysis during the 12th week of fermentation of meju developed by using ORIBS starter, 4.0 mg/L of hitamine was detected in the ORA experimental group and none was detected in the control, OR, and ORBA groups. In analysis of pathogenic microbes in meju developed by using the ORIBS starter, no pathogenic microbe was found or detected in all of the experimental groups. In analysis of aflatoxin of meju, none was detected in the control group, while 0.9 ㎍/kg was detected in the OR experimental group, 0.0 ㎍/kg in the ORA, and 0.1 ㎍/kg in the ORBA. In free sugars analysis of cheonggukjang developed by using the ORIBS starter, maltose content was the highest after 72 hours of fermentation, in the 40℃0.1% OR+B experimental group, with 5,158mg/L, which was more than 16 times higher than 50℃0.1% OR+B, 307mg/L, after 72 hours of fermentation. Of organic acids of cheonggukjang developed by using the ORIBS starter, lactic acid increased in the experimental group inoculated at 40℃ as fermentation progressed, and decreased in the group inoculated at 50℃. Succinic acid content, at inoculation temperature of 50℃, after 48 hours of fermentation, was 265~532 mg/L, and increased to 594~914 mg/L after 72 hours of fermentation. At 40℃, the contents were similar between the 24 hours and 72 hours of fermentation. Of biogenic amine of cheonggukjang developed by using the ORIBS starter, histamine content in the 50℃ OR+B 0.5% experimental group was 42.1 mg/L, and in the 50℃ OR 1% group 21.2 mg/L. In analysis of pathogenic microbes of cheonggukjang developed by using the ORIBS starter, negative result was found in all of the pathogenic microbes. In analysis of aflatoxin of cheonggukjang, none or 0.0 ㎍/kg was found. The overall free sugars content in doenjang developed by using the ORIBS starter decreased as fermentation progressed. Maltose content was the highest, 436 mg/L, in the OR experimental group during the 10th week of fermentation, and 108mg/L and 111mg/L in the control and ORBA experimental group respectively. Glucose content was 1,477mg/L in the ORA experimental group, and fructose content in the OR and ORA experimental groups 7630mg/L and 7366mg/L, respectively. Free sugars content in soy sauce, similar to that of doenjang, decreased as fermentation progressed. Lactic acid content in doenjang increased as fermentation progressed, and was 11,788mg/L in the control group, 10,872 mg/L in the OR, 8,490mg/L in the ORA, and 9,495 mg/L. Acetic acid content was the highest in the ORA experimental group, 1,433 mg/L. However, succinic acid was not found in any experimental group. Lactic acid content of soy sauce in experimental groups, except the control group, increased as fermentation progressed, and was the highest in the ORA experimental group, 11,840mg/L. Succinic acid, unlike doenjang, was detected in the control group and ORA experimental group, on the date of complete fermentation, 936mg/L and 3787mg/L, respectively. In doenjang developed by using the ORIBS starter, β-amylase activity was the highest in the control group after 10 weeks of fermentation, 421 unit, and similar in other experimental groups, around 340∼382 units. And, in soy sauce, the content was higher in the OR experimental group, 396 unit, than other experimental groups. Of biogenic amine of doenjang developed by using the ORIBS starter, except 0.6 mg/L of histamine in the OR experimental group, no histamine was found in doenjang and soy sauce. In analysis of pathogenic microbes, in experimental groups of both doenjang and soy sauce, negative results were found in salmonella spp., E. coli, stap. aureus, and Cl. perfringenes. However, as for B. cereus, in the doenjang OR and ORA experimental groups, 4.2×104 and 3.1×104 CFU/mL were detected respectively, and, in the soy sauce ORA experimental group, 3.2×102 CFU/mL. In analysis of aflatoxin in doenjang and soy sauce developed by using the ORIBS starter, none was detected in any of the experimental group.
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