초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
1. Pilot plant 적용 Test, 품질특성분석
우수균주(B.licheniformis BAD8)를 이용하여 복발효 메주를 만들고 품질특성을 분석하였다. 메주의 발효 8일째 총질소 함량이 5.39~5.75%의 함량을 나타내었으며, 총유리아미노산, 아미노산성 질소, 프로티아제 활성이 기존에 사용하던 메주에 비해 높았으며, 바이오제닉 아민 함량은 낮고 또한 이 메주를 이용한 간장 맛이 관능검사 순위법에서 제일 높게 보여주어 균주를 참여기업에 적용하도록 하였다.
우수균주를 이용하여 된장과 간장을

Ⅳ. 연구개발결과
1. Pilot plant 적용 Test, 품질특성분석
우수균주(B.licheniformis BAD8)를 이용하여 복발효 메주를 만들고 품질특성을 분석하였다. 메주의 발효 8일째 총질소 함량이 5.39~5.75%의 함량을 나타내었으며, 총유리아미노산, 아미노산성 질소, 프로티아제 활성이 기존에 사용하던 메주에 비해 높았으며, 바이오제닉 아민 함량은 낮고 또한 이 메주를 이용한 간장 맛이 관능검사 순위법에서 제일 높게 보여주어 균주를 참여기업에 적용하도록 하였다.
우수균주를 이용하여 된장과 간장을 염농도에 따라 제조한 결과 효모1종, 유산균1종, 세균1종을 최종 균주로 선발하였다. 본 균주를 활용하여 저염 된장 및 간장을 pilot scale로 제조하여 품질 및 미생물학적 특성을 살펴본 결과 일반 된장과의 차이는 크지 않았다. 또한 식중독 미생물은 검출되지 않았으며, 저염으로 제조한 된장 및 간장을 관능평가 한 결과 풍미 및 전체적인 기호도에서 양호한 판정을 받아 참여기업에게 기술이전 및 시생산을 실시하도록 하였다.
우수균주를 이용하여 저염 고추장을 제조한 결과 품질특성상 염도에 따라 큰 차이는 나지않았으며, 풍미와 관능평가면에서도 고염장류보다도 양호한 판정을 얻었다.
항균력이 강하고 향미성분이 뛰어난 균주를 혼합스타터로 사용함으로써 장류의 저염화로 야기될 수 있는 맛성분의 변화와 부패미생물의 생육을 방지하여 장류의 저염화가 가능할 수 있게 되었다.
또한 추가연구로 기업체에 바로 적용할 수 있는 최종제품에서 컨트롤 할 수 있는 저염 된장 및 즉석 된장국을 제조하였다. 저염 된장은 작두콩, 고추씨분말 등을 일정한 배율로 된장에 배합하여 관내 음식업주를 대상으로 선호도를 조사한 결과 80%이상의 높은 만족도와 추후 구입의사를 밝혔다. 또한 즉석 된장국은 기개발된 된장을 이용하여 컵에 물만 부어 식음할 수 있는 즉석 된장국을 개발하여 전통발효식품의 현대화 및 편리화로 경쟁력을 확보할 수 있도록 하였다.

2. 발효미생물 분리동정, 발효미생물 균주관리보존시스템 구축
가. 저염 관련 미생물에 대한 총균수 분석 및 동정 분석을 통한 microflora 확인
전통 된장에서는 저염인 4.8%, 8.4%의 총 균수와 균총의 pattern과 12%, 15.6% ,19.2%의 총균수와 균총의 pattern이 비슷했다. 호기성 세균과 호염성 세균의 경우에는 모든 염도와 전 숙성기간에 7-11 log CFU/g의 높은 수준으로 분리되었다. 호기성 세균과 호염성 세균의 균총은 발효 초기에 Bacillus licheniformis와 Bacillus amyloliquefaciens가 많은 비중을 차지하고, 발효 후기에 Bacillus subtilis가 우점종이 된 반면에, 12%, 15.6%, 19.2% 염도 된장에서는 발효초기부터 Bacillus subtilis가 된장 발효에 큰 관여하였다. 유산균의 총 균수를 보았을 때 4.8%, 8.4% 된장은 숙성 초기까지 유산균이 보였고, 12%, 15.6%, 19.2% 염도 된장에서는 control에서만 유산균의 총 균수가 측정되었다. 곰팡이의 확인된 총 균수를 보면, 저염 된장인 4.8%, 8.4% 된장 시료는 비슷한 총 균수 pattern을 보였는데, 비교적 꾸준히 약 2 log CFU/g 곰팡이가 분리 되었고 숙성 12개월에서는 저염 된장에서 곰팡이가 분리되지 않았다.
간장 발효의 경우에는 총 균수의 pattern이 4.8%, 8.4%, 12%, 15.6% 간장에서 거의 유사한 총 균수 분포를 보였고, 19.2% 간장은 약간 다른 미생물 총 균수 분포를 보여주었다. 호기성 세균과 호염성 세균의 경우에는 된장과 마찬가지로 모든 염도와 전 숙성 기간 동안 7-11 log CFU/g의 수준으로 분리 미생물의 큰 비중을 차지하였다. 간장의 호기성 세균과 호염성 세균은 염도별로 매우 다양하게 나타났다. 유산균이나 곰팡이의 미생물 총 균수 pattern은 모든 염도의 간장 시료에서 유사하게 나타났다. 효모는 된장, 간장에서 모두 숙성이 시작되기 전 control 중에서도 4.8% 염도에서만 약 2 log CFU/g의 낮은 수준의 분포를 보였으며, 그 외의 다른 시료에서는 분리되지 않았고, 전 숙성기간에서도 효모는 발견되지 않았다.
고추장의 경우, 호기성 세균과 호염성 세균은 된장, 간장과 마찬가지로 큰 변화 없이 많은 수준으로 분리되었다. 호염성 세균의 경우, 모든 염도에서 Bacillus licheniformis와 Bacillus subtilis가 큰 비중으로 차지하였다. 유산균은 숙성기간 동안 어떠한 경향성 없이 증감하였다. 고추장 유산균의 우점종을 보면, 모든 염도의 고추장에서 담금 직후인 Control에서는 동일하게 Lactobacillus brevis이 우점종이었으며, 숙성 1개월 이후에 모든 염도의 시료에서 균주가 분리가 되었던 유산균을 동정해 보았을 때, Lactobacillus fructivorans가 가장 많이 확인되었다. 효모 또한 유산균과 마찬가지로 총균수에 대한 편차가 심했다. 곰팡이는 가장 염도가 낮은 3% 고추장에서만 숙성 3개월까지 곰팡이가 분리되었으며, 나머지 6%, 10%, 15%, 20% 염도 고추장에서는 숙성 1개월부터 곰팡이가 분리되지 않았다.

나. 저염 고추장 미생물의 PCR-RAPD 패턴 비교 분석에 의한 유전체 정보 분석
숙성이 되면서 고추장의 전체 미생물 군집이 염도의 영향을 얼마나 받는지 보기 위하여, 같은 숙성 기간 내 염도 별 고추장 시료 각각에 대해 전체 DNA를 추출하여 random primer를 통한 RAPD-PCR 증폭을 수행한 후, DNA 단편 양상에 대해 Fingerprinting Ⅱ Informatix software를 이용하여 UPGMA dendrogram을 나타내어 비교하였다. 숙성 직후, 1개월, 2개월인 숙성 초기에는 3%, 6% 염도 고추장이 가까운 유연관계로 한 그룹으로 구분되고, 10%, 15%, 20% 염도 고추장이 또 다른 그룹으로 구분되었다. 고추장의 초기 발효 미생물 군집과 상관이 있을 것으로 보이며, 숙성 3개월에는 숙성 4개월에는 모든 염도의 시료가 상대적으로 높은 유사도 값을 가졌다. 숙성 5개월에는 염도의 차이가 클수록 유사도가 낮아지는 경향을 보였다. 숙성 후기인 10개월에는 다시 3%, 6% 염도 고추장이 가까운 유연관계로 한 그룹으로 구분되고, 10%, 15%, 20% 염도 고추장이 또 다른 그룹으로 구분되었다. UPGMA dendrogram에서 10%, 15%, 20% 염도 고추장끼리는 아주 가까운 유연관계를 가지는 반면에, 염의 첨가량이 적은 3%와 6% 염도 고추장의 두 시료의 미생물 군집끼리 가까운 유연관계를 가졌다. 염도가 낮은 3%와 6% 염도 고추장에서는 미생물의 생육을 저해하는 염의 양이 적었기 때문에, 숙성이 될수록 식품을 부패시키는 미생물의 생장이 일어난 것으로 사료되며, 부패 미생물의 DNA 단편이 고염 고추장과는 먼 유연관계를 나타내는 역할을 한 것으로 판단된다.

다. 저염 및 고염으로 제조된 전통 장류의 향기 성분 분석
된장의 주요 향기성분은 저염 시료에서 adehydes, alcohols, acids가 발효 초기부터 발효 3개월까지 많이 확인되었고, 발효가 진행됨에 따라 시료들 간의 격차는 점차 감소하였다. 또한, 저염 시료에서 발효 6개월부터 다양한 pyrazine이 형성되었다. 간장의 향기성분은 된장과 마찬가지로 저염화 시료에서 발효초기부터 발효 3개월까지 aldehydes, alcohols, acids가 높은 수준으로 확인되었다. 향미뿐만 아니라, 앞서 보았던 형태학적 특징과 미생물학적 특징을 고려하여, 일반적인 전통 장류보다 염도가 낮은 12% 장류가 일반적인 15-20% 염도의 전통 장류의 특성과 크게 다르지 않는 것으로 보아, 염도 12%까지 낮춘 저염 장류는 된장 및 간장의 장기간 발효에 문제가 없을 것으로 생각된다. 고추장의 향기성분은 alcohol류의 ethanol, ester류의 ethyl acetate와 3-methyl-1-butyl acetate, ketone류의 3-hydroxy-2-butanone, acid류의 acetic acid가 주요한 성분으로 확인되었다. Ethanol은 10%와 15%에서 많이 검출되었고, ethyl acetate는 3%, 6%, 10% 염도 고추장에서 상대적으로 높게 나타났으며, 반대로 발효유의 중요한 향기성분인 3-hydroxy-2-butanone은 염도가 높아질수록 높은 비율로 검출되었다. 3-Methyl-1-butyl acetate와 acetic acid는 저염 고추장에서 매우 높은 수치로 검출되었다. 일반적인 고추장의 미생물 패턴을 함께 고려하였을 때, 고추장은 10%까지 염도를 낮출 수 있을 것으로 사료된다.

라. 균주관리 및 균주특성에 대한 산업적 균주관리보존시스템 구축
각 과제별 분리된 미생물의 동결건조 및 초저온 동결보존을 통하여 미생물의 안전한 보존을 수행하였으며, 발효기간 중에 분리된 미생물의 동정 결과를 균주 관리시스템에 등록하여 균주 정보를 공유할 수 있도록 구축하였다.

3. 전통장류로부터 곰팡이, 세균 그리고 효모의 총체적인 분리 및 발효미생물의 최적배양시스템 구축
가. 저염 장류 생산에 투입 가능한 산업용 곰팡이, 세균 분리
(1) 저염 장류 생산에서 부패 병원성 증식 억제 능력을 가지는 항균 Bacillus 균주를 분리하고, 이들 균주들 중 저염 장류 생산에 안전성 확보와 풍미를 유지하기 위해 biogenic amines 분해 특성, protease 및 amylase 고생산, glutamate 고생산 특성을 지니는 균주의 분리했으며, 저염 장류 생산에 biogenic amine, aflatoxin을 생산하지 않으며 protease 및 amylase를 고생산하는 Aspergillus oryzae를 분리했다. 그 결과 전통 장류로부터 저염 장류 생산 시 문제되는 부패 유해 균주에 대해 항균 특성을 지닌 Bacillus licheniformis 25 종(국제 특허 출원균주 1종 포함)분리 및 aflatoxin 비생산, 고 protease 및 고 amylase 생산, biogenic amine을 생산하지 않는 Aspergillus oryzae 9종을 분리했음.
(2) 저염 장류의 부패형성 산막 효모의 증식을 억제하는 11종의 산업용 Bacillus 발효 균주의 분리. 저염 장류에서 부패형성 산막 효모의 순수 분리와 부패억제 Bacillus 균의 동정 및 paper disc assay에 의한 억제능 관찰했음. 8% 저염 장류에서 형성된 산막효모의 분리 및 동정한 결과 Pichia kudriavzevii 또는 Candida xylopsoci로 밝혀졌음. 이 산막 효모의 생성을 억제하는 우수 발효 Bacillus 균들을 동정한 결과 B. subtilis, B. licheniformis, B. methylotrophicus로 밝혀졌음.
(3) 저염 장류의 부패에 관여하는 부패세균의 증식을 pyrosequencing을 통해 분석하였고, 이세균들을 억제하는 10종의 Bacillus 균주를 분리. 저염 장류에서 부패를 유발하는 세균을 순수 분리하고 동정한 결과 Staphylococcus saprophyticus와 S. warneri로 동정되었음. 8% 저염 장류에 냄새를 유발하는 이 병원성 세균들을 대상으로 발효균인 Bacillus 균을 사용 paper disc assay에 의한 억제능을 관찰했음.
(4) 저염 장류 부패에 관여하는 Staphyloccus 속의 증식을 억제하는 13종의 Weissella 균주의 분리한 결과 Weissella cibaria, W. confusa, Leuconostoc mesenteroides로 동정되었음. 장류에서 다수의 저산생성 유산균인 Weissella, Leuconostoc을 분리하고 이 균들의 biogenic amine 생성량 및 분해능, glutamic acid 생성량을 관찰하여 13종을 최종 분리. 장류에서 유산균인 Weissella, Leuconostoc 균주를 사용, paper disc를 통한 Staphylococcus 속 균주의 억제능을 관찰.
(5) 발효 장류에 사용할 수 있는 11종의 Aspergillus, Rhizopus, Mucor 분리. Aflatoxin 생성능, Protease 및 amylase 생산, 증식 속도의 비교에 의한 균주를 선발 했음. Coconut milk 배지에 의한 aflatoxin 유무 검출, amylase, protease 생산 유도 배지를 사용하여 halo 관찰. 비교를 위해 표준 균주로 상용화된 충무발효 균주를 시용하여 비교했음.
(6) 전통 장류로부터 부패균에 대해 강한 길항 작용을 가지는 주요 발효 Bacillus 분리 및 동정을 위해 선발 균주들의 유해균 억제능과 amylase, protease 활성 및 glutamate 생성능에 대한 분석결과와 biogenic amine 분해율, γ-PGA와 발효취 분석에서 상대적으로 우수한 최종 균주 Bacillus subtilis 11종, Bacillus amyloliquefaciens 1종, Bacillus methylotrophicus 8종으로 총 20종을 분리 선발하였음.
(7) 전통 장류와 메주로부터 부패균에 대해 강한 길항 작용을 가지는 유산균을 분리하고 동정했음. 이를 위해 BCP가 첨가된 MRS agar배지에서 colony 주위가 노란색으로 변하며, dextran 생성 배지에서 Dextran을 생성하는 lactic acid bacteria를 1차적으로 선발하였음. 선발된 균주들을 다시 Entercoccosel agar배지에 계대 배양하여 colony 주위가 검게 변하는 균주들을 제거하여 최종적으로 Entercococcus가 제거된 110개의 lactic acid bacteria를 선발하였음. 선발된 균주들 중 다중의 부패균에 길항작용을 가지는 균주 20개 균주를 선발하였고, 이들 20개 균주는 11 종의 부패균에 각각 다른 길항 능력을 나타냈으며, 저염 장류에서 분리한 Enterococcus lactis에 대해서는 선발된 20개 균주 모두 길항 능력을 보이지 않았음. HPLC를 이용한 biogenic amine 분해 균주 선발했고 분석 결과 균주에 따라 biogenic amines의 분해율은 차이가 있었으며, 한 균주에서biogenic amine에 따른 분해율 또한 차이가 있었음. Tyramine은 최소 28%, 최대 50%를 분해하는 균주가 있었으며, Histamine은 최소 26%, 최대 65%를 분해하는 균주가 있었음. 전자현미경을 통해 형태학적 관찰 결과 전형적인 구균의 형태를 보였으며, 16S rRNA 염기서열을 통한 동정 결과 20개의 선발된 균주들 중 Leuconostoc mesenteroides 12개 균주로 가장 많았으며, Weissella cibaria가 7개의 균주, Weissella confusa 1개 균주로 동정되었음.
(8) 전통 장류와 메주로부터 저염 장류 제조에 상업적 용도로 사용할 수 있는 곰팡이 분리 및 동정했음. 총 92종의 시료로부터 154종의 곰팡이 균주를 분리했음. Aspergillus oryzae 균주를 분리하기위해 형태학적으로 Aspergillus속과 Penicillium속에 속하는 균주를 구별하기 위해 현미경 관찰을 통해 Aspergillus속과 Penicillium 속을 구별했음. Coconut 배지를 이용하여 aflatoxin 생성 여부를 확인했음. coconut 배지에서 aflatoxin을 생성하는 균주는 UV로 조사한 경우 Aspergillus flavus와 같이 aflatoxin에 의해 형광을 나타내기 때문에 형광의 발색여부로 aflatoxin 생성 여부를 확인했음. 그 결과 Aspergillus속에 속하면서 Aflatoxin을 생성하지 않는 Aspergillus oryzae 30종을 최종 분리하였음. 고체 배지 조건에서 분리 균주에 대한 Protease 및 Amylase 활성은 SCIM3 균주의 경우 분리한 균주 중 가장 높은 Protease 활성 능력을 가졌으며 Reference균주를 비롯한 타 균주에 비해 차이 폭이 컸음. 반면 Amylase 활성 능력은 Reference균주가 가장 우수했으며 SCIM19, SCIM20, SCIM21 균주가 Reference 균주보다 낮지만 전반적으로 분리 균주 중 가장 우수한 Amylase 활성 능력을 보였음. 전반적으로 Protease 활성 능력과 Amylase 활성 능력 모두에서 우수한 균주는 나타나지 않았지만 SCIM3, SCIM29 균주의 경우 전반적으로 모두 우수한 편에 속하였음. 액체 배지 조건에서 Amylase 활성 측정항 결과 SCIM12 균주가 가장 높은 Amylase 활성을 가진 것으로 나타났고 또한 고체배지 상에서 전반적으로 활성이 높았던 SCIM29 균주도 우수한 활성을 가졌음. 선발 균주의 유전학적 동정을 위해 18S rRNA와 28S rRNA의 부분 서열을 포함하는 ITS 영역의 유전자 염기서열을 동정하였고 선발된 균주의 염기서열 분석결과 Aspergillus oryzae와 99% 일치한 것으로 나타났음.

나. 전통장류로부터 발효 효모 군집분석 및 그로부터 분리된 알코올 발효 및 향미 증진 우수 균주의 분리와 저염화 장류로의 적용
전통 장류의 전반적인 발효기간 동안 효모 미생물 군집과 향미 성분의 변화를 살펴보았다. 발효기간 동안 효모의 생균수는 4.56×10³에서 9.06×10⁵으로 지속적으로 증가하는 경향을 보였으며, 특히 Candida, Pichia 및 Rhodotorula 균주가 전반적인 발효기간 동안 우점화 되어 있다는 것을 알 수 있었다. 반면 Debaryomyces, Microbotryum, Tetrapisispora, Torulaspora, Wickerhamomyces, Zygosaccharomyces 효모는 열세종으로 검출되었다. 또한 장류의 발효기간 동안 수행된 향미분석 결과, 장류의 초기단계에는 상대적으로 높은 함량의 alcohol류를 포함하였고, 발효가 진행됨에 따라서 점점 휘발성 acid류의 함량이 증가한다는 것을 알 수 있었다. 더욱이 본 연구에서는 이러한 장류의 발효기간 동안 분리된 효모 균주로부터, 높은 함량의 알코올을 생성하는 Torulaspora delbrueckii JBCC 623 균주와 높은 함량의 3-methyl-1-butanol을 생성하는 Pichia guilliermondii JBCC 848 효모 균주를 분리하였다. 장류의 각기 다른 발효 단계로부터 선발된 이 두 효모는 최종적으로 장류의 저염화로 발생될 수 있는 미생물학적 및 이화학적 변화를 조절하기 위한 스타터 균주로써 적용하였다. 즉, 다른 농도의 염을 함유하는 장류는 선발된 효모 균주의 단일 균주 또는 혼합균주 형태로 접종함으로써 발효한 후 염농도 및 스타터 종류별로 발효된 장류의 이화학적 및 미생물학적 변화의 차이를 살펴보았다. 그 결과, 효모 스타터를 적용한 모든 장류에서 염 농도의 저하로 인한 부패균인 Staphylococcus 및 Enterococcus sp. 균주를 저해 할 수 있었다. 더욱이 두가지 선발 효모를 단일 균주로 접종한 저염 발효 장류와 비교하여 혼합 균주로 접종한 발효 장류의 경우, 고염 발효 장류와 가장 유사한 향미 성분을 함유하는 것으로 나타나났다. 즉, 본 연구로부터 분리된 고 알코올 생성 효모 T. delbrueckii JBCC 623 균주와 향미 증진능 효모 P. guilliermondii JBCC 848 균주의 혼합 스타터를 사용함으로써 장류를 저염화로 인해 야기되는 향미 변화와 부패 미생물의 생육을 저해할 수 있다는 것을 확인하였다.

다. 발효미생물 균제 대량생산 scale-up 배양 공정에 대비한 저가의 산업용 복합 생산 배지 개발/ 발효미생물 균체의 액상·고상 배양을 위한 최적 발효조 확립 미생물의 산업적 생산을 위해서 생산 배지의 최적화 및 배양 조건의 확립은 필수적이다. 본 연구에서는 다양한 통계적 방법을 이용하여 반응 최적 조건을 결정하며, 대량 샌산을 위해 실험실 규모의 발효조에서 발효 조건을 확립하였다. 그 결과, Bacillus licheniformis SCK 121057의 균체량과 protease를 위한 최적배지 조성은 Galactose 17.26 g/L, Yeast extract 27.76 g/L, K₂HPO₄ 2 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.4 g/L, Na₂CO₃ 0.25 g/L, CaCl2 0.01 g/L 로 선정되었다. 또한 최적생산배지를 이용하여 발효조에서 최적발효조건 선정실험 결과, 배양온도, 교반속도, 공기유속과 pH는 각각 42 ℃, 200 rpm, 2 vvm, pH 8로 선정되었다. 이 때의 균체량과 protease는 7.24 g/L와 240.06 U/mL로 확인하였다. B. licheniformis BaDB 8 균주는 균체량과 protease의 최대 생산을 위한 생산배지 최적화 실험 결과, 최적배지 조성은 glucose 19.85 g/L, soybean meal 10 g/L, K₂HPO₄ 1.55 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.4 g/L, Na₂CO₃ 0.05 g/L, CaCl₂ 0.01 g/L 으로 설정할 수 있었다. 또한 Zygosaccharomyces bailii KCCM 101021 균주가 에탄올을 최대한 생산하기 위한 생산배지 최적화 실험을 진행하였다. 그 결과 최적 배지의 조성은 glucose:fructose(4:1) 102.87 g/L, yeast extract 10.63 g/L, Na₂NO₃ 1.66 g/L, KH₂PO₄ 2.0 g/L, CaCl₂·2H₂O 0.06g/L일 때 에탄올을 24.92g/L 생산하는 것을 확인 할 수 있었다. Z. rouxii KCCM 100971의 최적 배지 성분은 glucose 158; yeast extract 13.6 g/L MgSO₄ 2.04 g/L, KH₂PO₄ 1.5 g/L, CaCl₂ 0.2 g/L 로 확인 되었고, 에탄올이 54.26 g/L생산 되었고, 발효조건은 29℃, pH 5 and 200 rpm로 확인했다. 마지막으로 본 연구는 B. licheniformis SCK 121057와 Z. rouxii KCCM를 반복회분 배양을 해본 결과, 장기간 발효 하여도 안정하다는 결론을 얻을 수 있었다.

4. 산업적 적용 및 시제품 생산
우수한 균주를 선정하여 선정된 균주(Aspergillus oryzae SKM07 + Bacillus licheniformis SCKB11)와 기존에 사용하고 있는 균주(충무발효 종균 + Bacillus licheniformis SCC125037) 선정된 균주와 기존에 사용하고 있는 균주를 혼합한 균주((충무발효 종균 + Bacillus licheniformis SCC125037 ) + (Aspergillus oryzae SKM07 + Bacillus licheniformis SCK B11))를 된장과 간장을 저염과 고염으로 제조한 후 그 된장, 간장의 품질특성과 관능평가를 통해 분석하였다. 분석해본 결과 선정된 균주를 이용하여 제조한 저염 된장과 선정된 균주와 기존사용하고 있는 균주를 혼합한 균주로 제조한 저염 간장이 가장 우수한 특성을 보여 시제품으로 제작하였다. 고추장 제국에 사용된 곰팡이 균주는 충무발효(주)의 종균과 세균은 Bacillus licheniformis SRCM100027(대조구)과 1세부기관에서 제공 받은 Bacillus subtilis SCKB1307을 사용하여 4%, 8%, 12% 고추장을 제조하였다. 제조한 후 품질분석과 관능평가를 한 결과 4% 저염 고추장 중에서 대조구와 Bacillus subtilis SCKB1307을 사용한 균주가 가장 우수한 특성을 보여 고추장 시제품을 제작하였다.

Abstract ▼

Ⅲ.The result of Research and Development
1. Application Pilot Plant Test and Quality Characteristics
Two-step fementation meju was produced with superb stain (B.licheniformis BAD8) and quality characteristic was analyzed. The total nitrogen content at the 8th day of the fementation of meju was

Ⅲ.The result of Research and Development
1. Application Pilot Plant Test and Quality Characteristics
Two-step fementation meju was produced with superb stain (B.licheniformis BAD8) and quality characteristic was analyzed. The total nitrogen content at the 8th day of the fementation of meju was 5.39-5.75%, and activity of total free amino acid, amino acid nitrogen, protease activity was higher than existing meju. Biogenic amine content was low and the taste of soy sauce using this meju scored the highest with a sensory test. Therefore the stain was chosen to be applied to participated company.
Yeast 1, lactobacillus 1, and bacteria 1 were selected as final strains by the result of soybean products with each salt concentration. Low-salt doenjang and soy sauce pilot produced with these strain. However, quality and microorganism characteristics were indifferent with typical doenjang. Food pathogens was not found and scored fine in sensory test so technique transfer and pilot production were carried out.
Low-salted gochujang with superb strain showed negligible difference with salt concentration and scored higher than high-salted gochujang for overall taste and flavor. Therefore, by using the strain with stronger antibacterial activity and flavor ingredient as a mixed starter, the change of flavor ingredient and the growth of spoilage microorganism could be prevented, and lowering of salt content of paste was achievable.
Additionally, low-salted doenjang and instant doenjang soup was produced which are directly applicable to industry by performing additional research. The low- salted doenjang was made by mixing horse bean, chili seed powder in a certain proportion. The survey result from restaurants owners within near area showed satisfaction over 80% and intension of purchase. And the instant doenjang soup using the doenjang developed could be cooked simply by pouring hot water into a cup which was intended to secure competitiveness traditional fermentation food by modernization and facilitation.

2. Identification and isolation of food fermented microorganisms and establish of their control and preservation system
The fermented food in Korea is one of major korean food, and a traditional jang of the fermented food is the most important for seasoning. However, high salinity of a traditional jang is an issue for reason of health. So, identifying the lowest salinity of a traditional jang, changes in microflora, flavor and physicochemical properties with five different salt concentrations during fermentation periods were analyzed.
In the case of doenjang, the viable cell numbers of aerobic bacteria and halophile bacteria showed a steady increase from all sample during fermentation period. The major bacterial species in low-salted doenjang sample were Bacillus licheniformis and B. amyloliquefaciens. The viable cells numbers of fungi were identified at small amount in all samples. The main Volatile Flavor compounds were aldehydes, alcohols and acids in low salt samples from control to 3 month of fermentation periods. Various pyrazines were detected in low-salted doenjang as fermentation continues.
In the case of ganjang, the viable cell numbers of aerobic and halophilic bacteria showed no noticeable changes. The major bacterial species were Bacillus amyloliquefaciens, B. licheniformis, and B. subtilis like doenjang sample. As fermentation continues, various species of bacteria were identified. Lactic acid bacteria was detected only in control (0 month), and yeast was identified only in 4.8% salted ganjang. The viable cells numbers of fungi were identified at small amount in all samples like doenjang. In like manner doenjang, the main Volatile Flavor compounds were aldehydes, alcohols, and acids in low salt samples from control to 3 month of fermentation periods.
In the case of gochujang, the viable cell numbers of aerobic and halophile bacteria did not show noticeable changes during fermentation. The major bacterial species were identified Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis regardless of Salinity of gochujang. But the isolated bacteria in 3%, 6% salted gochujang were identified as more diversity of species. The viable cell numbers of lactic acid bacteria was showed much higher spreads during fermentation. The viable cell numbers of yeast was showed much higher spreads like lactic acid bacteria during fermentation. The viable cells numbers of fungi were identified at small amount in all samples like doenjang and ganjang. The main Volatile Flavor compounds were 3-Methyl-1-butyl acetate of ester group and acetic acid of acid group in low-salted gochujang. However, 3-hydroxy-2-butanone in ketone group was detected as main aroma in 10 and 15% salted gochujang.

3. The overall isolation of fungi, bacteria and yeast strains from traditional soy products, and the construction of optimal culture system of microorganisms
A. Isolation of industrial fungi and bacteria for the production of low-salted soybean products
In order to inhibit the growth of pathogens and degrade biogenic amines during the fermentation of soybean products, an isolate with antimicrobial activity against pathogens and biogenic amine-degrading property was obtained from 83 traditionally fermented soybean products. The morphological and biochemical tests and the phylogenetic relationship among 16S rRNA gene sequences indicated that the isolates were most closely related to Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis or B. amyloliquefaciens. The cell-free supernatant of two day cultures was active against several pathogens including Enterococcus faecalis, Listeria monocytosis, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, and Staphylococcus aureus. PCR analysis was conducted to determine relatedness to antimicrobial lantibiotics and biosurfactants produced by Bacillus spp., but showed negative for the genes encoding surfactin, lichenysin, and lichenicidine. Electron microscopic observation indicated that the antimicrobial agent seemed to attack the membrane of the pathogens, leaving the ghost or shrunken cells. The strains were found to reduce biogenic amines including histamine, tyramine, putrescine, and cadaverine by 27 to 92%in the cooked soybean containing 5.3% of biogenic amine over 10 days of fermentation time. The use of selected strain would be a potential control measure in manufacturing traditionally fermented soybean products that are difficult to control pathogens and biogenic amine levels.
Soybean pastes with 8% (w/w) salinity were prepared instead of soybean paste with 14% (w/w) salinity to meet the growing demands of Korean’s low sodium diet. After aging, white films had appeared on the surface of all low-salted soybean pastes (8% (w/w) salinity) unlike high-salted soybean pastes (14% (w/w) salinity). All of eight microbes isolated from the surface film were identified as Pichia kudriavzevii . Eleven Bacillus strains with good characteristics of fermentation were isolated from traditionally fermented soybean pastes in order to preserve their unique flavors and aromas after aging, and as a result of analyzing the biochemical characteristics and 16S rRNA sequences, those were identified as B. subtilis, B. licheniformis, and B. methylotrophicus. All of the Bacillus isolates had antagonistic activities against 8 isolates of the film-forming yeasts and harbored the genes for synthesis of antimicrobial surfactants including lichenysin and/ or surfactin.
Leuconostoc spp. and Weissella spp. were isolated from traditionally fermented soybean products in order to select the lactic acid bacteria for the reduction of biogenic amines and harmful bacteria. Both of them were identified by the 16S rRNA sequence analyses and additional biochemical tests. The strains were found to reduce biogenic amines including histamine and tyramine by 25.92 to 64.61% when it grew in minimal synthetic media containing 0.1% (w/v) histamine and 0.1% tyramine at 30℃ for 48 h. The strains also had broad inhibition spectra against pathogens. Considering their properties, they could be used as industrially applicable starters for soybean fermentation.

B. Analysis of yeast community during overall fermentation of traditional soy sauce, the isolation of high alcohol-producing and flavor-enhancing yeast strains and their application for salt-reduced soy sauce development
The yeast microbial communities and flavor profiles were monitored during traditional soy-sauce fermentation. During the fermentation, the numbers of yeast were consistently increased from 4.56×10³ to 9.06×10⁵ cfu/mL. Particularly, Candida, Pichia and Rhodotorula sp. were predominately found throughout the fermentation with Debaryomyces, Microbotryum, Tetrapisispora, Torulaspora, Wickerhamomyces, Zygosaccharomyces sp. as minor strains. In case of flavor profiles, soy-sauce at initial fermentation stage showed high contents of volatile alcohols and then volatile acids constantly increased as the time course. In addition, two salt-tolerant yeast strains producing high ethanol and 3-methyl-1-butanol, Torulaspora delbrueckii JBCC 623 and Pichia guilliermondii JBCC 848, were isolated at different stages during the spontaneous fermentation of Korean soy sauce, respectively, and then finally applied in order to control the microbial and flavor changes occurring in the reduced salt process. Namely, soy sauce with a different salt concentration was fermented by inoculating a single or mixed cultures of yeast strains, in which the selected two yeasts were used; then, their physicochemical and microbial differences were examined. Overall, the application of yeast starter cultures resulted in a growth inhibiting effect on putrefactive bacteria, in which Staphylococcus and Enterococcus sp. were considerably decreased despite the low-salt concentration. Moreover, of the three starter cultures tested, the mixed culture of T. delbrueckii JBCC 623 and P. guilliermondii JBCC 848 was most promising, as a flavor analysis revealed that its application allows them to achieve a balance of more complex and richer flavors with the identical flavor profile pattern obtained from the soy sauce fermented with a high-salt concentration.

C. Development of a low cost production medium for industrial scale mass production of microorganisms/ Establish best fermenter for liquid, solid fermentation culture of microorganisms
Optimization of the production medium and culture conditions is essential for the industrial production of a microorganism. This study determined the optimal reaction conditions using statistical methods and established optimal fermentation conditions for mass production in a laboratory scale fermenter. The production medium composition for the D.C.W and protease activity of Bacillus licheniformis SCK 121057 was found to be (g/L); Galactose 17.26 g/L , Yeast extract 27.76 g/L , K₂HPO₄ 2 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.4 g/L, Na₂CO₃ 0.25 g/L, CaCl₂ 0.01 g/L. Furthermore, when using the optimized medium in the fermenter, the best fermentation conditions were determined to be temperature 42℃, stirring speed 200 rpm, air flow rate 2 vvm and pH 8. Under these conditions, D.C.W and protease activity achieved 7.24 g/L and 240.06 U/mL, respectively. Production medium optimization resulted for the maximum D.C.W and protease of B. licheniformis BaDB 8 as glucose 19.85 g/L, soybean meal 10 g/L, K₂HPO₄ 1.55 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.4 g/L, Na₂CO₃ 0.05 g/L, CaCl₂ 0.01 g/L. In addition, experiments were conducted to optimize the production medium for maximum production of ethanol by Zygosaccharomyces bailii KCCM 101021 and Z. rouxii KCCM 100971. Ethanol of Z. bailii KCCM 101021 producted 24.92 g/L, when the optimization medium composition determine glucose:fructose(4:1) 102.87 g/L, yeast extract 10.63 g/L, Na₂NO₃ 1.66 g/L, KH₂PO₄ 2.0 g/L and CaCl₂·2H₂O 0.06 g/L, ethanol producted 24.92 g/L. Ethanol of Z. rouxii KCCM 100971 producted 24.92 g/L, when the optimization medium composition determine glucose 158 g/L yeast extract 13.6 g/L MgSO₄ 2.04 g/L, KH₂PO₄ 1.5 g/L, CaCl2 0.2 g/L. The fermentation conditions for Z. rouxii KCCM 100971 were 29℃, pH 5 and 200 rpm. B. licheniformis SCK 121057 and Z. rouxii KCCM 100971 remained stable for a long time during repeated batch fermentation.

4. Industrial Application and Production of Prototype
High blood pressure and belongs to the world-class Koreans, compared to a lot of the recommended intake to 4,831 mg / day salt in take(WHO recommended dose : 2000 mg / day(2011)). In Korean, excessive sodium intake leads to adults diseases such as high blood pressure. To reduce this, it strives to reduce the salt intake of Korea government. Although the consumer and government demands for low-salt formula, traditional food is a situation that still produces more than 14% of high-salt products. For this reason, we want to investigate the possibility of manufacturing as a low-salt foods to traditional foods in this task. Selection of superior strains to inhibit spoilage microorganism fermentation the final selected strains(Aspergillus oryzae SKM07 + Bacillus licheniformis SCK B11) and strains that use conventional(Choongmu fermentation + Bacillus licheniformis SCC125037) , a mixture strains((Choongmu fermentation + Bacillus licheniformis SCC125037 ) + (Aspergillus oryzae SKM07 + Bacillus licheniformis SCK B11)) prepared by low-salt Sauce and high-salt Sauce then were analyzed by the quality characteristics and sensory evaluation. The results showed the best properties were commercialized a low-salt Doenjang (manufactured by selected strains) and low-salt Soy sauce(prepared by mixing the strain). Kochujang was prepared using a strain of the choongmu fermentation + Bacillus licheniformis SRCM100027, Aspergillus oryzae SKM07 + Bacillus subtilis SCKB1307, choongmu fermentation + Bacillus licheniformis SRCM100027 + Aspergillus oryzae SKM07 + Bacillus subtilis SCKB1307(Salt of 4%, 8%, 12%). The results showed the best properties were commercialized a low-salt Kochujang(prepared by mixing the strain).