초록 ▼

Ⅳ. 연구개발 결과
1. PRNP 제거 세포를 위한 PRNP 시퀀싱 세포 확립
가. 한우 세포 확보 및 PRNP발현 조사 및 분석
(1) 한우의 태아세포는 임신된 자궁에서 분리하였고, 성체 세포는 홍천 한우 클러스터 사업단에서 검증된 ‘한우퀸’ 귀조직의 생검을 통하여 분리하였다. 그 이외에도 화성 목장과 장수군 한우 목장의 도움을 받아서 10여두의 한우 세포를 분리 배양하였다.
(2) 한우 세포에서 PRPN발현 조사 및 분석
(가) 한우의 세포에서 mRNA를 추출하여 cDNA를 만들어서 유전자 발현을 비교

Ⅳ. 연구개발 결과
1. PRNP 제거 세포를 위한 PRNP 시퀀싱 세포 확립
가. 한우 세포 확보 및 PRNP발현 조사 및 분석
(1) 한우의 태아세포는 임신된 자궁에서 분리하였고, 성체 세포는 홍천 한우 클러스터 사업단에서 검증된 ‘한우퀸’ 귀조직의 생검을 통하여 분리하였다. 그 이외에도 화성 목장과 장수군 한우 목장의 도움을 받아서 10여두의 한우 세포를 분리 배양하였다.
(2) 한우 세포에서 PRPN발현 조사 및 분석
(가) 한우의 세포에서 mRNA를 추출하여 cDNA를 만들어서 유전자 발현을 비교 분석하였다. 한우의 primary 세포의 경우 PRNP 발현이 개체에 따라 다를 수 있다는 점을 규명하였다.

나. PRNP제거를 위한 불멸화 세포 개발
- 체세포를 불멸화 상태로 만들기 위하여 BMI유전자 또는 TERT유전자를 발현시키는 아래 그림과 같은 DNA vector를 제작하였으며, 이들 DNA를 체세포 도입하여 한우의 불멸화를 유도하였다.
- BMI 또는 BMI와 TERT유전자의 발현을 통해 만들어진 불멸화 세포는 passage를 거치면서 senescency를 거치지 않고 지속적인 doubling time을 가지고 장기간 성장하였으며 또한 Single 세포 콜로니의 형성 및 성장 속도가 크게 향상된 것으로 보여 불멸화가 성공적으로 수행되었음을 확인하였다.

2. PRNP 제거된 수정란 생산을 위한 최적의 미세 주입법 및 체세포 핵이식 조건 수립
가. 미세주입 확립
- PRPN KO 영양막세포 배양을 위한 초기 실험으로서, reporter DNA를 microinjection (미세주입)을 수행하였다. 미세주입을 조건을 위하여 pcDNA3.1-mCherry-stopsv40p-neomycinR-stop유전자를 이용하였으며 미세 주입을 실시한 후 배아는 단위 발생을 화학적 조건을 이용하여 유도하여 배양을 하고 유전자 발현을 검토하였다. 배양 후 7일째 형광 현미경 하에서 관찰한 결과 아래와 같이 RFP 유전자가 잘 발현되는 것을 관찰하였다.

나. 불멸화 세포를 이용한 복제 배반포 생산 효율 비교
- 대조군 세포와 2개의 불멸화 세포주(RAP, TERT)를 이용한 체세포 핵이식란의 발육율을 비교한 결과 분할율에서는 각 군간 유의적 차이는 없었으며 배반포 발육율에서는 TERT 군에서 유의적으로 높은 배반포로의 발육율(22.1, 22.0 vs. 28.4)을 보였다.

다. 공여핵원용 불멸화 세포주 종류에 따른 소 핵이식란의 발육 속도 비교
- 불멸화 세포주 종류에 따른 체세포 핵이식란의 발육 속도를 비교한 결과 TERT 세포주를 이용한 군에서 빠른 배반포 발육율 속도를 보였다.

라. 공여핵원용 불멸화 세포주 종류에 따른 소 핵이식란의 내부세포괴 비율 비교
- 체세포핵이식란의 질적 평가를 위한 지표로서 내부세포괴수/영양막세포수를 비교한 결과 TERT 불멸화 세포를 이용한 배반포에서 상대적으로 좋은 지표를 보였다.

마. PRNP제거가 된 불멸화 세포를 이용한 복제 배반포 생산 및 효율 비교
- 불멸화 세포에서 PRNP가 제거된 세포 라인을 확립하고 확립된 세포별로 체세포 복제 실험을 한 결과는 아래와 같다.

3. Genome editing 기술을 이용한 PRNP 유전자 제거
가. ZFN제작 및 준비
(1) Cow PRNP ZFN 개발
- 확보된 ZFN/TALEN의 활성을 소 세포내에서 검증하기 위해 Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/)를 이용하여 primer를 고안하고 한우 세포의 genomic DNA에서 PRNP target site의 PCR 과정을 확립하였다. Gradient PCR을 통해 최적화된 PCR melting temperature를 결정하였다.
(2) ZFN 검증 및 개선
- ZFN 활성 검증은 리포터시스템을 이용하여 이루어 졌다. 툴젠의 리포터 시스템은 유전자가위의 활성에 따라 정량적으로 세포에서 형광단백질을 발현하여 유전자 가위의 활성을 조사하는 중요한 도구로 특히 리포터에서 관찰되는 활성은 세포내의 원하는 유전자 부위를 자르는 실제의 활성과 높은 상관관계를 보여 유전자가위의 대량생산을 위해 유용하게 사용되고 있다. 먼저 합성된 각 ZFN의 목적 서열을 포함하는 활성 리포터를 제작하고 293T 세포 내로 도입하여 형광 단백질의 발현을 측정하여 1차로 활성이 관찰되는 ZFN을 찾아내었다. 이후 ZFN의 FokI 부분을 활성 및 특이성이 개선된 형태의 nuclease variant (DAS/RR, RR/DAS)로 교체하여 다시한번 활성 조사를 진행하여 ZFN에 따라 더 높은 활성을 갖는 ZFN 구조를 확인하였다. 이를 통해 2 pair의 Cow PRNP ZFN을 확보하였다.

나. TALEN 제작 및 준비
(1) Cow PRNP TALEN 제작
- 2009년 새롭게 발견된 맞춤형 염기결합 도메인 구조인 TAL effector 염기결합 도메인의 모듈을 이용한 유전자가위인 TAL effector nucleases (TALEN)이 최근 크게 각광을 받고있다. 툴젠은 독립적 연구를 통해 자체의 TALEN 구조 및 생산 시스템을 구축하였으며 이를 이용한 PRNP TALEN 개발을 진행하였으 ZFN과 같은 과정으로 고안 및 합성을 진행한 후 유전자가위 활성 리포터를 이용하여 활성을 조사하였으며 이를 통해 4 pair의 고활성 TALEN을 확보하였다.
(2) TALEN 리포터 제작 및 검증
- 세포 내에서 활성 확인된 PRNP TALEN의 인식서열을 합성하여 MACS reporter에 cloning하여 PRNP TALEN MACS reporter를 제작하고 sequencing으로 서열 검증하였다.
(3) TALEN 실험결과
- 총 12쌍의 TALEN pairs를 Immortalization 세포에 prnp talen유전자 nucleofection을 실시한 후 제 2협동 연구팀에서 mutation assay를 실시하여 prnp ko할 수 있는 쌍을 선별하였으며 이중 가장 활성이 좋았던 TALEN을 선정하여 추후 KO 실험에 사용하였다.
- 유전자 KO 효과가 있는 pair에 대해서 enrichment 실험을 위하여 reporter를 제 2협동 연구팀에서 제작하였고, 이렇게 완성된 talen DNA를 maxi-prep을 통해서 많은 양의 DNA를 확보하였다.
- 확보된 DNA를 가지고 한우 태아 섬유아세포에 nucleofection을 실시하여, RFP/GFP발현을 확인하고, MACS sorting을 하여 유전자 변형 세포을 일차적으로 enrichment를 하였다.
- Enrichment 괸 세포의 PRNP locus를 T7E1 assay를 이용하여 분석한 결과 mutation의 도입이 관찰되었으며 특히 MACS를 이용한 enrichment를 통해 돌연변이 도입 세포가 농축된 것을 확인할 수 있었다. 또한 해당 세포 pool의 PRNP locus에 대한 돌연변이 서열 분석을 통해 실제로 KO를 일으킬 수 있는 frameshift 돌연변이가 들어간 것을 보았다.
- KO clone을 얻기 위해 Enriched cell population에서 총 6개의 싱글세포 콜로니를 확보하고 돌연변이 분석을 진행한 결과2개의 콜로니에서 mutation이 관찰되었다. 이 세포를 제 2협동 연구팀에서 mutation assay를 한 결과 prnp유전자에 mutation이 관찰이 되었고, mutation된 결과를 시퀀싱한 결과 2개의 콜로니에서 mutant형태가 관찰되었다.
- mutation assay를 한 후 남은 세포를 싱글세포 콜로니로 키워서 싱글 콜로니 유래의 세포를 확보하기 위하여 실험을 하였다. 총 6개의 콜로니를 확보하였고, 그 중에서 2개의 콜로니를 얻었고, 얻어진 콜로니 중 2개의 콜로니에서 mutation이 관찰되었다.
- 같은 과정으로 PRNP KO 세포주를 소 체세포 및 불멸화 체세포에서 제작하여 그 효율을 분석한 결과 불멸화 체세포가 DNA전달 효율 및 성장성이 좋은 이유로 전체 KO cell line 구축 과정에서의 효율이 소 체세포에 비해 높았다.

4. 불멸화 세포와 기본 세포에서 PRNP유전자 제거 효율 비교 테이블
가. PRNP-KO 확인
- 확보된 PRNP gene knockout 소 불멸화 체세포의 genotype을 확인하여 각 clone들이 가지고 있는 framefshift 돌연변이의 모양을 확인하였다.
나. 복제 배아에서 PRNP-KO확인
- 또한 확보된 PRNP KO 불멸화세포주의 복재 배반포를 제작 후 확보된 배반포의 PRNP locus 서열을 분석하였을 때 공여세포가 가지고 있는 PRNP 돌연변이가 그대로 관찰되어 PRNP 유전자 녹아웃 복제 배반포가 성공적으로 생산 되었음을 확인하였다.
다. mRNA 단계에서 복제 배아 PRNP-KO 확인
- PRNP KO 복재 배반포에서 PRNP 유전자의 mRNA 발현을 RT-PCR로 조사한 결과 몇몇 돌연변이 type에 따라서는 PRNP mRNA의 발현이 현저히 줄거나 사라진 것을 관찰할 수 있었다.

Abstract ▼

Due to the decline in the livestock industry in Korea, a research was financed by a grant from the Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, “Generation of PRNP knockout embryos using zinc finger nucleases and verification of its knockout”. The mission was to This research was performed to ge

Due to the decline in the livestock industry in Korea, a research was financed by a grant from the Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, “Generation of PRNP knockout embryos using zinc finger nucleases and verification of its knockout”. The mission was to This research was performed to generate the PRNP knockout embryos using zinc finger nucleases and verify the its knockout. within a project duration date of 3 years.
1. Establishment of the of HanWoo cell lines for PRNP sequencing to remove the PRNP gene
1) Significant differences in the expression of PRNP gene was confirmed after comparing of transcripts in the RT-PCR of PRNP.
2) Establishment of bovine immortalized cell lines for PRNP-KO.
2. Intracytoplasmic injection and somatic cell nuclear transfer to produce the bovine PRNP-KO embryos.
1) Establishment of optimal methods for intracytoplasmic injection of PRNP genetic scissor.
2) Investigation of the most efficient immortalized cell lines in bovine somatic cell nuclear transfer
3. Removal of PRNP gene using genome editing
1) Development of efficient ZFNs systems for PRNP-KO
2) Development of efficient TALENs systems for PRNP-KO
4. Verification of PRNP-KO in the cloned bovine embryos
1) Production of cloned embryos using PRNP-KO cells
2) Confirmation of PRNP-KO in the cloned bovine embryos
We performed this Our research findings show possibility of production of PRNP-KO cows by genetic scissors (ZFNs and TALENs) and somatic cell nuclear transfer and its application into development of the livestock industry is possible. Our research can be applied to other biotechnology and medical field including with production of cloned pig for xenotransplantation.