초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
1. 제 1세부기관
가. 대상균주의 대량배양조건 확립
B. pyrrocinia CAB08106-4 균주의 상품화를 위해 필요한 대량배양조건을 확립하였다. 항균활성과 생육정도를 동시에 충족시키는 탄소원과 질소원을 조사하여 13종의 탄소원과 8종의 질소원 중 Glucos와 (NH4)2SO4를 최종 선발하였다. 또한 각각의 탄소원과 질소원의 농도는 1%, 0.1%에서 가장 좋은 것으로 나타났으며 추가 영양원으로 Yeast extract 1%를 최종 선발하였다. 최적 배양 조건은 28℃, 150rpm an

Ⅳ. 연구개발결과
1. 제 1세부기관
가. 대상균주의 대량배양조건 확립
B. pyrrocinia CAB08106-4 균주의 상품화를 위해 필요한 대량배양조건을 확립하였다. 항균활성과 생육정도를 동시에 충족시키는 탄소원과 질소원을 조사하여 13종의 탄소원과 8종의 질소원 중 Glucos와 (NH4)2SO4를 최종 선발하였다. 또한 각각의 탄소원과 질소원의 농도는 1%, 0.1%에서 가장 좋은 것으로 나타났으며 추가 영양원으로 Yeast extract 1%를 최종 선발하였다. 최적 배양 조건은 28℃, 150rpm and pH7 이었다.
나. 제형 및 처방 확립
B. pyrrocinia CAB08106-4 균주는 마늘 흑색썩음균핵병원균에 우수한 활성을 나타내는 길항미생물로 희석 살포하는 희석제나, 토양에 직접 살포하는 입제의 형태를 고려하였으며 균주의 특성이 Bacillus속 균주처럼 아포자를 형성하지 않기 때문에 온도와 장기보관에 민감함으로 균의 활성과 유지에 유리한 입제를 제형으로 선발을 하였다. 입제 제조는 조립식과 흡착식의 두 가지 방법이 있는데, B. pyrrocinia CAB08106-4 균주가 열과 계면활성제 성분에 매우 약하여 조립식으로 제조는 불가능하여, 최종 흡착식 입제를 선택하여 제품을 제조하였다.
다. 제품제조 및 이화학적 안정성확인
확립한 대량배양조건으로 B. pyrrocinia CAB08106-4균주를 액상원제(1×109cfu/ml)로 제조하여 흡착식 입제로 시제품을 제조하여 이화학실험과 유효성분의 안정성을 확인하였다. 온도조건에서는 정온(30℃)과 실온(4℃～34℃), 균주의 특성이 호기성임을 고려한 천공과 진공포장조건 및 상품화를 위한 소량포장과 대량포장조건에 따른 유효생균수의 변화를 측정하였다. 시험결과 실온보관과 천공포장으로 제조하였을 경우에 12개월까지 유효생균수의 측정이 가능하였다.
라. 제품의 효과검증
B. pyrrocinia CAB08106-4균주를 배양한 후 흡착식 입제로 제조하여 천연작물보호제 등록 신청시 필요한 병원성 실험을 하였다. 수생식물 2종과 육상식물 4종에 대해 실험한 결과 병원성이 나타나지 않아 안전성을 확인하였다. 그리고, 미생물제제의 약효검증을 위해 마늘 종구파종전 2011년 11월 10일에 토양혼화 처리하여 예비시험을 수행하였다. 시험결과 20kg 처리구에서 66.0%의 방제효과를 나타냈으며 10kg에서는 62.3%로 무처리와 유의차가 있었고, 5kg에서는 35.8%로 유의차가 없었다. 사용량에 있어서 10kg와 20kg의 경우 20kg에서 방제효과가 더 높았으나 유의차가 없어 제품화 이후 판매가를 고려하여 10kg으로 결정하였다.
마. 천연작물보호제 등록을 위한 약효, 약해시험 및 현장실증시험
B. pyrrocinia CAB08106-4 GR의 천연작물보호제 등록신청을 위하여 공인 시험기관인 한국식물환경연구소와 식물보호연구소에서 마늘 흑색썩음균핵병에 대해 약효.약해 시험을 2년간 실시하였다. 시험방법은 마늘 파종전 10kg/10a로 토양혼화처리 한 후 수확기에 최종 조사하였다. 2년간 시험한 성적 모두에서 무처리 대비 50%이상의 방제효과를 나타내어 천연작물보호제 등록신청에 만족하는 결과를 나타내었다. 또한, 제주와 고흥에서 실시한 농가 현상실증시험결과에서도 50%이상의 방제효과를 나타내어 상품화 후 1회 처리가 아닌 지속적으로 처리를 한다면 미생물의 토양내 밀도를 높여줌으로써 방제효과를 더 높일 수 있을 것으로 생각된다.
2. 제 1협동기관
가. 길항미생물의 특성 검정
마늘 흑색썩음균핵병균의 증식을 억제하는 B. pyrrocinia CAB08106-4 균주는 상추 잿빛곰팡이병, 균핵병, 생강 근경썩음병, 고추 탄저병 등 다범성 항균스펙트럼을 갖고 있고, 대부분의 당을 탄소원으로 이용할 수 있었다. 또한 길항미생물 B. pyrrocinia CAB08106-4 균주는 20ppm의 황산스트렙토마이신에서도 생육이 가능하기 때문에 토양 정착시 기타의 미생물에 대하여 우점할 수 있을 것으로 판단된다. 그리고 이 균주는 마늘 이외의 작물 발아에 독성을 나타내지 않았다. 따라서 CAB08106-4 균주는 미생물 농약으로서 광범위한 작물에 사용이 가능하며 약해의 위험성이 없을 것으로 생각된다.
나. 항균활성물질의 특성 검정
B. pyrrocinia CAB08106-4 균주의 배양액으로부터 마늘 흑색썩음균핵병에 항균확성을 보이는 물질의 분리를 위해 ethyl acetate 및 chloroform을 첨가하여 유기 용매 분획물을 제조 하였다. Chloroform 분획은 silica gel 크로마토그래피를 이용하여 항균 활성을 갖는 chloroform-methanol 분획을 얻었고, 이 항진균 물질은 6 개의 양성자 및 1H 및 13C NMR 스펙트럼에 의해 10 개의 탄소로 구성된 방향족 화합물 인 것을 밝혔다. 1H-1H COSY 스펙트럼, HMBC 스펙트럼 및 HMQC 스펙트럼에서이 방향족 화합물은 1,2,3-trisubstituted benzene 과 pyrrole로 구성되어 있었다. NMR 분광법으로 이 활성물질은 분자식 C10H6Cl2N2O2, 분자량 265의 pyrrolnitrin으로 확인하였다.
다. 항균활성물질의 정량분석
B. pyrrocinia CAB08106-4 균주는 배양 배지별 항균활성에 차이를 나타내었는데, 배양액 1㎖의 양으로부터 추출된 활성물질은 KB(King’s medium B)에서는 생산이 확인되지 않았고, TSB(tryptic soy broth)에서는 72시간 배양하였을 때 소량 확인되었다. NB(nutrient broth)와 LB(Luria-Bertani media)에서는 배양 48시간에서 항균활성이 확인되었고, PSB(potato sucrose broth)에서는 배양 48시간부터 72시간 까지 항균활성물질이 생산되었는데, 48시간에서 가장 큰 활성을 보였다. 이때의 pyrrolnitrin 생성량은 22.9ng/ml 이었다.
라. 흑색썩음균핵병 발생 모니터링
마늘 흑색썩음균핵병은 4월 초부터 시작되어 4월 중순부터는 발병이 급격하게 증가하는 특성이 있었다. 지역별 마늘 흑색썩음균핵병의 발생면적률은 충남 서산지역이 3.0∼6.8%, 충남태안지역은 4.5∼5.4%, 경북 의성군은 0.2∼1.1%, 전남 해남군은 1.9∼2.8%, 제주시는 0.4∼2.4%로 각각 조사 되었다. 충남지역에서는 난지형 및 한지형 마늘 모두 4월 중순부터 발병하기 시작하였고, 해남군은 4월 상순, 제주도는 3월 하순부터 이며, 의성군은 5월 초 발병하였지만 1% 미만의 발병율을 보였다.
마. 미생물제제의 방제효과 실증
한지형 마늘의 초장 경태 등 생육 상황은 미생물제제의 처리에 의하여 차이를 보이지 않았다. 하지만 출현률은 무처리구에 비하여 유의적으로 증가하였다. 미생물제제의 흑색썩음균핵병 방제효과는 한지형과 난지형 마늘 각각 58.3∼66.0%, 74.6∼64.2%로 평균 70% 정도를 나타내었다. 이처럼 B. pyrrocinia CAB008106-4는 매년 65% 이상의 안정적인 방제효과를 보이는 매우 우수한 생물방제인자이며, 농가 포장에서 지속적인 방제효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
바. 미생물제제의 적용 확대
B. pyrrocinia CAB08106-4 제제는 쪽파의 흑색썩음균핵병에 대하여도 우수한 방제효과를 보였다. 2년간 무처리구의 발병률은 12.9∼17.1%로 방제효과 검토에 충분하였고, 방제가는 55.6∼58.9%로 생물적 방제제로서의 효과가 인정되는 수준이었다. 이러한 결과는 마늘 흑색썩음 균핵병에 대한 길항미생물제제가, 다른 작물의 흑색썩음균핵병에 대하여도 방제효과를 유지함을 나타내는 것이며, 쪽파 이외의 양파, 달래 등 적용확대의 가능성이 매우 높고 다범성의 생물적 방제인자로 기대할 수 있다.
3. 제 2협동기관
가. 원제의 안전성 평가
Burkholderia pyrrocinia CAB08106-4 균주의 원제의 안정성 평가를 위해 농촌진흥청 고시 독성시험 기준과 방법에 준하여 시험을 실시하였다. Rat를 이용하여 급성경구, 경피, 정맥, 호흡기, 병원성을 평가하였다. 시험결과 병리학적 소견이 관찰되지 않았으며, 모든 그룹에서 미생물이 검출되지 않았다. 또한, 환경독성 시험에서도 투여량 6.67 × 104 cfu/mL에서 잉어와 물벼룩에서 독성이 발견되지 않아 시험물질의 안정성을 확인하였다.
나. 친환경유기농업자재 목록공시 신청을 위한 안전성 평가
친환경유기농업자재 공시를 위한 시제품의 독성평가 연구를 수행하였다. 시제품의 급성 독성/병원성, 급성 경구, 경피, 안점막에 대한 독성을 평가한 결과, Burkholderia pyrrocinia CAB08106-4 GR가 모든 시험항목에서 안전성이 확이 되었다. 또한, 환경독성시험에서 잉어와 물벼룩에 6.67 × 104 cfu/mL양으로 노출시 치사개체가 발견되지 않았으며, 물벼룩에 대한 LC50 값은 9.07 × 104 cfu/mL였다.
다. 천연작물보호제 등록신청을 위한 제품의 안전성 평가
천연작물보호제 등록신청을 위한 시제품의 독성평가 연구를 수행하였다. 급성 경구, 병원성, 급성 경피. 안점막에 대한 독성을 평가하였다. 시험결과 Bukholderia pyrrocinia CAB08106-4 GR(1.0 × 106cfu/g) 가 모든 시험항목에서 독성이 없는 것을 확인하였다. 환경독성평가의 결과에서도 잉어와 물벼룩에 6.67 × 104 cfu/mL을 투여하여 시험한 결과 치사개체가 발견되지 않다.

Abstract ▼

White rot of garlic occurred the first in Goheung province in 1988. The symptoms appear as rising of temperature. White rot of outbreak on garlic, onions, leeks, and scallions in a soil-borne disease, is expanding gradually on cultivated area. This disease occurs violently in garlic cultivation of f

White rot of garlic occurred the first in Goheung province in 1988. The symptoms appear as rising of temperature. White rot of outbreak on garlic, onions, leeks, and scallions in a soil-borne disease, is expanding gradually on cultivated area. This disease occurs violently in garlic cultivation of fields, particularly, the damage is large Nan-Ji than Han-Ji garlic.
White rot fungus will enable long-term survival in the soil in the dormant state, but this reason, the more difficult the control of this disease is a reality. Control of this disease depends on chemical pesticide in domestic. Chemical control is effective for control of white rot. But Continuous use of chemical products and abuse can cause problems like pollution of the soil and safety of crops. Therefore, Development of the biological control using microorganisms is necessary. In this study, to improve marketability and stable production of garlic, and control an effective technique for the development and commercialization of biopesticides using Burkholderia pyrrocinia CAB08106-4 strains that produce antimicrobial substance to white rot disease was carried out to establish the control system.
The results obtained are summarized as follows.
1. Condition for mass culture of antagonistic bacterium
We established optimum culture conditions of B. pyrrocinia CAB08106-4 strains. The optimum culture conditions including temperature, pH, enzyme activity, carbon and Nitrogen sources were determined. The optimum cultural conditions of B. pyrrocinia CAB08106-4 strains were 28℃, 150rpm and pH7. The highest cell growth and antifungal activity was obtained with 1% glucose and 0.1% (NH₄)₂SO₄, respectively.
2. Established formulations and recipe.
B. pyrrocinia CAB08106-4 strains has antifungal activity against white rot of garlic. We selected granular formulations with considered this strains characteristics. There are two methods of Granular formulations by impregnation and assembly. This strains has weak characteristics about heat and some surfactants. Assembly formulation needs some surfactant and generates heat in manufacturing process. Therefore, Final microbial formulations selected granular formulation by impregnation.
3. Product manufacturing and Check physicochemical stability.
Validity period is the important factor for development of microbial formulations. We investigated cell numbers of B. pyrrocinia CAB08106-4 strains by storage temperature and packaging conditions. First of all, We cultured B. pyrrocinia CAB08106-4 strains(1×10⁹Hcfu/ml) using the optimum mass culture conditions. And We investigated physicochemical stability after microbial formulations manufacturing. The result of experiments, B. pyrrocinia CAB08106-4 strains was possible to keep cell numbers until 12 months in case of room temperature storage and perforated packaging.
4. Control effect of microbial formulations.
Pathogenicity tests were required when applying for registration. We confirmed safety about two kinds of aquatic plants and the four kinds of land plants. In addition,. We carried out preliminary test through the method of soil mixing treatment with micobial formulations before planting garlic on November 10, 2011. The micobial formulations represented control effect of 66.0, 62.3 % on 20kg, 10kg/10a treatments. respectively.
According to the result, 20kg/10a was high than 10kg/10a but there is not significant.
And then we determined amounts of 10kg/10a in consideration of the sales price in the after development
5. Field trials for biopesticide registration
KPER(Korea Plant Environmental Research Station) and Plant Protection Institute carried out field trials of microbial formulation for 2 years. The method of test is soil mixing treatment with 10kg/10a microbial formulation before planting garlic. The control efficacy of it showed about 61.0 to 66.0%. That results indicate that microbial formulation is sufficient to control of white rot of garlic. In addition, We tested the microbial formulation for commercial in Jeju and Goheung. Also. The control efficacy showed above 50%.
As a result, The microbial formulation can expected to improve control effect by increasing the density of microorganism in soil.
6. Characteristics of antagonistic microorganisms
B. pyrrocinia CAB08106-4 strain has wide antifungal spectrums such as gray molds of lettuce, Sclerotinia disease, rhizome rot of ginger, anthracnose of red pepper, and can be used as a carbon source for most of the sugar. In addition, CAB08106-4 strain is capable of growth in streptomycin sulfate of 20ppm, it can be dominant against microorganisms in the soil at the time of colonization. Then, this strain did not show toxicity to the germination of other crops. So B. pyrrocinia CAB08106-4 strain, is capable of use in a wide range of crops as a microbial pesticide, and there is no risk of the chemical injury.
7. Antibacterial properties of the active substance
We were prepared organic solvent fraction for the identification of the antifungal substance producing B. pyrrocinia strain CAB08106-4 against white rot disease of garlic by adding ethyl acetate and chloroform to the culture medium. With silica gel column chromatography in chloroform layers showing the antimicrobial activity, the antimicrobial activity was detected in chloroform-methanol fraction. This antifungal substance was found to be aromatic compound composed of six proton and ten carbon by ¹H and ¹³C NMR spectrum. From the ¹H-¹H COSY spectrum, HMBC spectrum and HMQC spectrum, this aromatic compound consists of a 1,2,3-trisubstituted benzene and pyrrole. As a result of a database and literature search on the basis of results, the compound was found to be in good agreement with pyrrolnitrin. In NMR spectroscopy, pyrrolnitrin confirmed the 265 molecular weight, the molecular formula C₁₀H₆Cl₂N₂O₂.
8. Quantitative analysis of the antifungal substance
B. pyrrocinia CAB08106-4 strains showed a different antifungal activity in the several culture medium. When the active substance is extracted from the amount of the culture medium 1㎖, the active substance is not identified in the KB, was produced in small quantities for 72 hours from the TSB culture.
Antifungal substance were produced when cultured 48 to 72 hours at PSB, showed the maximum activity at 48 hours, yields of pyrrolnitrin at that time was 22.9ng/ml(media).
9. Monitoring of white rot incidence
White rot of garlic is initiated from the beginning of April, the onset is rapidly increased from mid-April. Diseased area ratio are 3.0 to 6.8% at Seosan district, 4.5 to 5.4% at Taean district. 0.2 to 1.1% at Euiseong, and 1.9 to 2.8% at Haenam, respectively. Garlic of Chungnam province was all starting to onset from mid-April, Haenam is the beginning of April, and Jeju from late March, although the incidence of the disease was less than 1% in early May in Seoul.
10. Control effects of microbial formulation
The growth of garlic, especially plant length and stem diameter, there was no differences by treatment of microbial formulation. However, emergence ratio was significantly increased compared to untreated control plot. The control efficacy of microbial formulation showed about 58.3 to 66.0% in Han-Ji and 74.6 to 64.2% in Nan-Ji garlic, respectively.
Average control effect of three years was about 70%. In this way, B. Pyrrocinia CAB008106-4 is a very useful biological control factor to show the control effect were stable more than 65% every year, and can be expected sustainable control effect on farmers fields.
11. Expanded application of microbial formulation
We investigated the control effect on white rot of shallot for the expanded application of microbial formulation. Control efficacy was the level of effect as biological control agents are found in the 55.6 to 58.9%. These results indicate that it contains control effect antagonistic microorganism agents to white rot of garlic, also white rot of other crops, have potential application expansion to onion, shallot, wild garlic, and it is expected to serve as biological control agents which has the ability of broad spectrum ranges.
12. Toxicity test of the Burkholder pyrrocinia CAB08106-4 culture broth
The aim of this study was to assess and to compare the pathogenicity of B. pyrrocinia CAB08106-4 in rats through oral, intranasal and intravenous single dosing. The environmental toxicity using Cyprinus carpio and Daphnia magna. B. pyrrocinia CAB08106-4 (1.0 × 10⁹Hcfu/mL) was administrated to Cyprinus carpio and Daphnia magna according to the toxicity test guideline for pesticide. For the result that examined the numbers of internal/external microbes, they were not detected in every group. The pathological findings were not observed in relation to the administration of the B. pyrrocinia CAB08106-4 in the necropsy result to survived animals. It could be concluded that the tested microorganism was not toxic or pathogenic to rats via oral, intranasal and intravenous route. No effect was observed at 6.67 × 10⁴ cfu/mL and we concluded that B. pyrrocinia CAB08106-4 has no toxicity for Cyprinus carpio and Daphnia magna.
13. Toxicity test of the microbial formulation for registration of Eco-friendly organic product
The acute oral toxicity/pathogenicity, acute dermal toxicity, skin and eye irritation studies were performed using animal. In summary, the present study demonstrated that the B. pyrrocinia CAB08106-4 is not acutely toxic via dermal route and would not cause skin and eye irritation to tested animals. Acute oral toxicity/ pathogenicity were not observed in relation to the administration of the B. pyrrocinia CAB08106-4 in the necropsy result to survived animals. It could be concluded that the tested microorganism was not toxic or pathogenic to rats via oral. The environmental toxicity using Cyprinus carpio and Daphnia magna. B. pyrrocinia CAB08106-4 GR(1.0 × 10⁶cfu/mL) was administrated to Cyprinus carpio and Daphnia magna according to the toxicity test guideline for peciticide. There was no mortality and adverse effect in any of the fish exposed to 6.67 × 10⁴ cfu/mL. The 21 days LC50 value of B. pyrrocinia CAB08106-4 GR(1.0 × 10⁶cfu/mL) to Daphnia magna were determined 9.07 × 10⁴ cfu/mL.
14. Toxicity test of the microbial formulation for registration of biopesticide.
The acute oral toxicity/pathogenicity and acute dermal toxicity studies were performed using rats. Skin and eye irritation studies were performed using rabbits and skin sensitization study performed using guinea pigs. In summary, the present study demonstrated that the B. pyrrocinia CAB08106-4 is not acutely toxic via dermal route and would not cause skin and eye irritation or hypersensitivity to tested animals. Acute oral toxicity/pathogenicity were not observed in relation to the administration of the B. pyrrocinia CAB08106-4 in the necropsy result to survived animals. It could be concluded that the tested microorganism was not toxic or pathogenic to rats via oral. The environmental toxicity using Cyprinus carpio. B. pyrrocinia CAB08106-4 GR(1.0 × 10⁶cfu/mL) was administrated to Cyprinus carpio according to the toxicity test guideline for pesticide. There was no mortality and adverse effect in any of the fish exposed to 6.67 × 10⁴ cfu/mL.