초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
초기 연구개발 목표대로 역유전학을 이용하여 증식성이 좋은 PCV2a 바이러스에 증식성이 낮은 PCV2b 등의 다른 유전형의 ORF2를 이식한 4종의 키메라 바이러스를 만들어 다가백신으로 개발하였음(시험백신1). 2종은 107 TCID50/ml 이상의 증식성을 보였으며, 나머지 2종은 106 TCID50/ml의 증식성을 보였음. 개발된 PCV2백신을 평가하기 위한 PCV2 진단법 개발을 위해 ORF2 유전형을 구분할 수 있는 마우스 단큰론항체 11종을 확립하였음. 그 중 PCV2 각 유전형을 모두 검출할 수 있

Ⅳ. 연구개발결과
초기 연구개발 목표대로 역유전학을 이용하여 증식성이 좋은 PCV2a 바이러스에 증식성이 낮은 PCV2b 등의 다른 유전형의 ORF2를 이식한 4종의 키메라 바이러스를 만들어 다가백신으로 개발하였음(시험백신1). 2종은 107 TCID50/ml 이상의 증식성을 보였으며, 나머지 2종은 106 TCID50/ml의 증식성을 보였음. 개발된 PCV2백신을 평가하기 위한 PCV2 진단법 개발을 위해 ORF2 유전형을 구분할 수 있는 마우스 단큰론항체 11종을 확립하였음. 그 중 PCV2 각 유전형을 모두 검출할 수 있는 단클론 항체 6C8클론 및 Symbiotic사 ELISA kit을 이용하여 PCV2 백신의 항원량을 정량한 결과 바이러스를 배양해 생산한 백신은 항원량에서 재조합 VLP백신의 항원량에 1/10이하로 확인되었음. PCV2b 바이러스를 불활화 하여 제조한 시험백신1의 항원량을 보강하기 위하여 baculovirus vector를 이용하여 PCV2 각 유전형별 ORF2단백을 곤충세포에서 발현한 4종의 VLP항원을 추가로 개발하였음. 곤충세포에서의 제조합 항원 발현은 20L 생산단위 까지 최적의 생산 조건을 확립하였으며, 시험백신1(PCV2b 키메라 virus)에 VLP type의 PCV2a, PCV2d항원을 첨가한 “시험백신 2”를 개발하여 3개 batch를 생산하였다. 시험백신2를 기니피그 및 SFP닭에 접종하여 비교한 항체 형성능은 기존 다국적 백신과 동일 수준인 1024배(IFA)이상 이였음. SPF 돼지에서의 효능평가 시험에서 PCV2b 야외주와 PRRSV를 함께 공격접종하고 thymus에서의 바이러스 배출 정도를 비교한 결과 대조군에 비해 시험백신2를 접종한 돼지에서 10,000배 이상의 PCV2 바이러스 감소 효과를 보였음. 또한 해외에서 새롭게 보고되고 있는 PCV2의 면역회피항원에 대한 재조합 항체 단백질 C4-1 및 C4-8을 개발하여 PCV2의 면역회피항원을 정량할 수 있는 기술을 확보하였음. 이를 이용하여 PCV2 백신 중 회피항원 노출정도를 검사할 수 있는 품질검사법이 확랍되었으며, C4-1 및 C4-8 면역회피항원 특이 단백질을 이용한 경쟁 ELISA법 개발로 PCV2에 의한 항체진단에서 감염된 동물과 백신접종 동물의 혈청의 구별이 가능할 수 있는 기반 기술을 확보하였다.

Abstract ▼

Ⅳ. Results of Research and development
As the original objective of this research and development, with the reverse genetics, low proliferating genotype ORF2 of such as PCV2b etc were implemented to high proliferating PCV2a and four kinds of chiremeric virus, multi-valent vaccine was developed(Te

Ⅳ. Results of Research and development
As the original objective of this research and development, with the reverse genetics, low proliferating genotype ORF2 of such as PCV2b etc were implemented to high proliferating PCV2a and four kinds of chiremeric virus, multi-valent vaccine was developed(Test vaccine 1). Two kinds of virus were showed a proliferation ability by over 107TCID50/ml and the rest two kinds of virus 106TCID50/ml. To set up diagnostic method to evaluate the vaccine, 11 kinds of mouse-derived monoclonal antibody were established, which could be differentiate each ORF2 genotype. With monoclonal antibody 6C8Clone and Symbiotic ELISA kit, that they could detect all genotype, antigen amount of PCV2 vaccine was quantified and it was found that antigen amoun of the vaccine produced from whole virus culture was less than one of recombinant VLP vaccine by one tenth. To bolster antigen amount in Test vaccine 1(PCV2b killed vaccine), four kinds of VLP antigen which were each ORF2 protein of each genotype expressing in insect cells were additionally developed with baculovirus vector.
Recombinant antigen expressing in insect cells has been established by 20L production unit and Test vaccine 2 has produced by three batch by adding VPP type PCV2a and PCV2d antigen to Test vaccine 1(PCV2b chimera virus). The antibody lebel by injecting Test vaccine 2 to guinea pigs and SPF chickens was the same to that of current multinational vaccines by 1024 times(IFA). In efficacy evaluation test in SPF pigs, which were challenged by PCV2b field strain and PRRSV at the same time, Test vaccine 2 group showed better PCV2 virus reduction than control group by 10,000 times through assaying virus level of each thymus. And qualifying method for PCV2 decoy antigen, which has been newly reported abroad, has been established by developing recombinant antibody protein C4-1 & C4-8 which are specific to PCV2 decoy antigen. Using this method, quality test on PCV2 vaccine has been set up to measure decoy antigen level. and by developing competitive ELISA test by using specific protein of C4-1 and C4-8 decoy antibody in terms of PCV2 antibody diagnosis, the basic technology to differentiate infected animal's serum from vaccinated animals has been secured.