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5. 최종 연구결과 요약

[제1세부과제] 줄기세포를 이용한 발달신경독성 평가 모델 확립

가. 마우스 줄기세포를 이용한 발달신경독성 모델 확립
1) 신경분화 유도 최적조건 확립
- 세개의 서로 다른 분화법 (NS법, SP법, SC법)을 이용하여 신경세포로의 분화능을 비교결과 저용량 발달신경독성평가에 가장 적합한 분화법으로 NS법 결정
2) 신경분화 단계 및 신경세포별 특이 발현 유전자 선발
- 선택 된 NS법으로 분화를 진행시켜 분화 시작 후 0, 5, 10일째에 gene ch

5. 최종 연구결과 요약

[제1세부과제] 줄기세포를 이용한 발달신경독성 평가 모델 확립

가. 마우스 줄기세포를 이용한 발달신경독성 모델 확립
1) 신경분화 유도 최적조건 확립
- 세개의 서로 다른 분화법 (NS법, SP법, SC법)을 이용하여 신경세포로의 분화능을 비교결과 저용량 발달신경독성평가에 가장 적합한 분화법으로 NS법 결정
2) 신경분화 단계 및 신경세포별 특이 발현 유전자 선발
- 선택 된 NS법으로 분화를 진행시켜 분화 시작 후 0, 5, 10일째에 gene chip 분석
- 분화 10일째에 발현이 2배이상 증가한 gene 중 GO분류상 “neurogenesis" 관련 유전자 선택, K-means clustering 실시
- Cluster1: 신경세포의 분화, 발생과 관련한 유전자 그룹에 각각 43%와 33%의 유전자들이 속함
- Cluster2: 신경세포의 분화, 발생, 신경돌기발달과 관련된 유전자 그룹이 확인되었으며 GO 분류상 신경세포분화와 관련한 그룹 중에는 희소돌기아교세포의 전사와 관련한 인자들이 포함됨
- Cluster4: 신경의 분화 및 발생과 관련한 유전자그룹에 각각 47%, 33%의 유전자가 속해있으며 이 외에도 세포성분의 형태발생에 관여하는 유전자 그룹들이 다수 포함
3) 신경분화 단계 및 신경세포별 특이 발현 유전자 및 단백질 발현도 조사
- NS법으로 분화 시 신경계의 분화 양상과 비슷하게 marker 들이 변화함
- 분화 10일째에 현저한 neuron, astrocyte, oligodendrocyte 마커단백들이 발현함
나. 인체 줄기세포를 이용한 발달신경독성 모델 확립
1) 인체역분화줄기세포(hiPS)를 이용한 신경줄기세포 분화법 확립
- 인체 역분화 줄기세포 Kor-WT-iPSC3를 6일간 배상체로 유도→N2배지에서 2일간 부착 및 신경외배엽 분화유도→신경유도배지에서 2일간 배양 후 떠오르는 sphere 모음→accutase로 세포 분리하여 신경증식배지에서 배양→7일간 증식 후 accutase 이용 계대→신경전구세포 (NPC) 특성 확인
- 총 17일간 분화로 NPC 세포괴 유도: 신경전구세포마커 (SOX1, SOX2, nestin, pax6) 및 신경세포마커(Tuj1) 발현 확인
- 약 7일 간격으로 지속적 계대 가능함을 확인하였음
2) 신경분화세포별 특이 발현 유전자 및 단백질 검색
- 신경전구세포 특이 발현 유전자: PAX6, PLZF 발현증가
- 신경세포 특이 발현 유전자: TUJ1 발현증가
- 신경전구세포 특이 발현 단백: SOX1, SOX2, NESTIN, PAX6 발현
- 신경세포 특이 발현 단백: TUJ1 발현

[제2세부과제] 줄기세포를 이용한 화학물질의 만성 저용량 노출에 의한 발달신경독성 평가

1) 저용량 발달신경독성 평가를 위한 시험물질 선정
- 메틸 수은: 대표적 발달신경독성 물질
- Ciprofloxacin (CPX) 과 bibphenyl acetic acid (BPAA) 병용투여: Fluoroquinolon과 NSAID 약물로서 병용투여 시 GABA 억제 상승작용이 알려져 있음
2) 시험관 내 저용량 발달신경독성 평가법 확립
- 세포주: 역분화줄기세포 (H9) 유래 신경줄기세포를 분화배지 (N2B27)에서 신경세포로 20일간 분화유도
- 저용량 발달독성평가를 위한 화학물질 농도: 메틸수은 100~400 nM, CPX 25~100 μM, BPAA 50~200 μM
3) 만성 저용량 노출이 신경분화단계별 특이 유전자 및 단백질에 미치는 영향 평가
- 신경전구세포 특이 발현 유전자 (NESTIN, PROMININ) : 저용량 (100-200 nM)에서 증가, 400nM에서 감소
- 신경세포 특이 발현 유전자인 TUJ1, GAD67 발현 저용량 (100-200 nM)에서 증가, 400nM에서 감소
- 신경세포 특이 마커 단백: TUJ1 발현이 유의하게 증가함
4) 만성 저용량 노출이 신경세포 기능에 미치는 영향 평가
- High-content screening (HCS) 결과 미토콘드리아 막활성 변화, 산화스트레스로 인한 과산화지방질 축적, 세포질 내 칼슘이온 농도 등 변화 나타남
- Membrane Potential Assay로 막전위변화를 확인한 결과 200-400 nM에서 막전위 감소양상 확인됨
- Neurite outgrowth 측정 결과, neurite length, neurite max length with branches, neurite intensity, branch point, cross point 등이 MeHg 용량 증가 (100-400 nM)에 따라 감소하는 경향 나타남
5) 만성 저용량 노출이 후성유전학적 변화에 미치는 영향
- BDNF promotorⅣ의 일부 CpG site에서 methylation이 증가하는 경향이 나타남

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 수의과학기술개발연구사업 연구과제 최종결과보고서 ... 2
• Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 5
• 1. 연구배경 ... 5
• 2. 연구최종목표 ... 6
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 6
• Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 7
• 1. 재 료 ... 7
• 2. 연구전략 및 방법 ... 7
• Ⅲ. 연구결과 ... 8
• 제1세부과제 줄기세포를 이용한 발달신경독성 평가 모델 확립 ... 8
• 제2세부과제 줄기세포를 이용한 화학물질의 만성 저용량 노출에 의한 발달신경독성 평가 ... 38
• Ⅳ. 연구결과요약 ... 45
• 제1세부과제 줄기세포를 이용한 발달신경독성 평가 모델 확립 ... 45
• 제2세부과제 줄기세포를 이용한 화학물질의 만성 저용량 노출에 의한 발달신경독성 평가 ... 46
• Ⅴ. 고 찰 ... 47
• Ⅵ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 47
• 끝페이지 ... 48