초록 ▼

4. 최종 연구결과 요약

세부과제명: 국내 괴사성장염 특성조사 및 CP균 특이 박테리오파지 선발
○ 가금 괴사성장염 발생 사례를 분석한 결과 대부분 육계에서 발병되었으며 주 발생일령은 2-3주령 때 그리고 평균폐사율은 3.23~10% 수준이었음
- 괴사성장염과 복합감염되는 대표적 질병으로는 콕시듐증과 대장균증으로 확인됨
○국내 육계에서 준임상형 괴사성장염 발생율 조사를 실시하였음
- 도계장에서 육계 소장(십이지장, 공장, 회장)를 채취한 다음 조직학적 검사를 통해서 준임상형과 콕시듐증 감

4. 최종 연구결과 요약

세부과제명: 국내 괴사성장염 특성조사 및 CP균 특이 박테리오파지 선발
○ 가금 괴사성장염 발생 사례를 분석한 결과 대부분 육계에서 발병되었으며 주 발생일령은 2-3주령 때 그리고 평균폐사율은 3.23~10% 수준이었음
- 괴사성장염과 복합감염되는 대표적 질병으로는 콕시듐증과 대장균증으로 확인됨
○국내 육계에서 준임상형 괴사성장염 발생율 조사를 실시하였음
- 도계장에서 육계 소장(십이지장, 공장, 회장)를 채취한 다음 조직학적 검사를 통해서 준임상형과 콕시듐증 감염여부를 조사함
ㆍ무항생제 사육 10개 농가 200수를 대상으로 조사한 결과 준임상형 괴사성장염 발생율은 공장 11.0%, 회장 10.0%, 십이지장 8.0%순이었음. 반면 항생제 사육 10개 농가에서 준임상형 발생율은 공장과 회장 각 6.0%, 십이지장 3.5%로 확인되어 무항생제 농가에서 준임상형 괴사성장염 발생이 높은 것으로 확인됨
- 콕시듐 감염증은 십이지장에서 가장 높은 발병율을 보였으며 무항생제 사육농장의 십이지장 콕시듐 감염율은 34.5%, 항생제 사육농장 콕시듐 감염율은 29.5% 수준이었음
○ 건강한 닭과 괴사성 장염으로 폐사한 닭의 독소 (cpa, cpb2, pfoA, netB, tpel)의 유무를 PCR로 조사한 결과, 다른 독소에서 두 그룹간의 차이는 없었으나 netB 독소의 경우 건강한 닭 (4.0%)보다 괴사성 장염으로 폐사한 닭 (47.1%)에서 훨신 높은 비율로 존재하였음
○ Bacteriophage 분리용 시료 1,147점(닭분변 944, 오폐수124, 토양 106)를 채취한 다음 Spot assay법과 Plaque assay법을 이용하여 파지 분리실험을 수행함
- 괴사성장염 특이 파지는 84개가 분리되어 7.32%(84/1,147) 분리율을 보였음.
- 분리된 파지(4종)에 대한 전자 현미경조사 결과 8각형 head와 한개의 tail를 갖고 있은 것으로 조사되어 모두 Siphoviridae 바이러스로 확인됨.
- 괴사성장염 임상분리주 7주(유전적을 상이함) 대상으로 분리된 파아지 lysis여부를 조사한 결과 SJФ14, SJФ21, YS3-2, MJG 6-1 가 비교적 넓은 Host spectrum을 가지고 있음
-비교적 높은 활성을 가지는 7개의 파지를 RAPD PCR로 분석한 결과 각각의 파지는 유전학적으로 상이하였음.

세부과제명: 괴사성장염 평가모델 개발 및 CP 특이 bacteriophage 실용화
○ 괴사성장염 유발을 위해 처음 콕시듐 3종(E. acervulina, maxima, tenella)을 접종 농도를 103-105/ml로 접종하여 병변유발 효과를 확인한 결과 최적조건 E. maxima(104/ml)를 확립하였음
○ 다음 괴사성 장염 모델의 공격접종 균주 선발을 위해 2개 균주(JSH, KJW)를 일반 육계에 3회(18, 19, 20일령) 접종하고 콕시듐 원충(Eimeria maxima)과 혼합 감염시킨 다음 괴사성 장염 발병율을 조사한 결과 JSH접종 그룹에서만 41.6%의 폐사율이 확인되어 공격접종 균주로 선발하여 괴사성장염 모델개발에 성공함. 그러나 이 균주를 lysis하는 파아지를 조사했으나 발견하지 못함.
○ 따라서 파아지(SJФ14)를 첨가한 사료를 닭에 급여한 후에 CP균을 경구투여하고 닭을 부검해서 맹장분변에서 CP균의 감소여부를 조사하는 실험을 진행함
- 실험결과 병원성 파아지를 투여하고 CP균을 접종한 그룹은 파아지를 투여하지 않은 그룹에 비해 CP균이
유의성 있게 감소함. 따라서 아 파아지는 괴사성 장염 억제제로 활용할 수 있을 것으로 판단함
○ CP 특이 박테리오파지의 산업적 응용을 위한 분리 박테리오파지의 순수분리
- 농림축산검역본부로부터 제공받은 1차선발 박테리오파지 10종 (SJ14, 55B, 55D, 55E, 58F, 55A, 56A, MSG, CJØ, YS3-2)에 대하여 순수분리를 실시하여, 5종의 박테리오파지의 순수분리 성공 (SJ14, 55B, 55D, 55E, 58F)
○ CP 특이 박테리오파지의 산업적 응용을 위한 순수분리 박테리오파지의 소규모 증식공정 개발
- 순수분리가 달성된 5종의 박테리오파지들 (SJ14, 55B, 55D, 55E, 58F)에 대하여 적합 소규모 증식공정 (500 ml)을 개발. 박테리오파지 증식 수준은 모두 107 pfu/ml 이상이 달성되었음
○ CP 특이 박테리오파지의 산업적 응용을 위한 순수분리 박테리오파지의 소규모 정제공정 개발
- 소규모 증식공정 개발 후, 이에 부합하는 소규모 정제공정을 개발. Polyethylen Glycol 침전법 기반 정제법을 1차 정제법으로 개발하고 (순도: 80% 이상), chromatography 기반 정제법을 2차 정제법으로 개발 (순도: 90% 이상)
○ CP 특이 박테리오파지의 산업적 응용을 위한 순수분리 박테리오파지의 특성분석
- 소규모 정제공정 개발까지 달성된 박테리오파지들의 경우, 후속 실험으로 향후 산업화를 고려하여, 구조적 특성분석, 유전적 특성분석, 생물학적 특성분석, 내열성 조사, 내산성 조사, 항균력을 조사함
○ CP 특이 박테리오파지의 산업적 응용을 위한 활용 박테리오파지의 선발
- 박테리오파지들의 특성규명 결과를 고려하여 산업적 활용성이 높은 박테리오파지로 SJ14를 선정
○ CP 특이 박테리오파지의 산업적 응용을 위한 선발 박테리오파지에 적합한 액상 및 고상 제형 제품 개발
- 박테리오파지가 적용된 닭 괴사성장염 예방 및 치료 제제에 적합한 제형을 개발 (액상 및 고상 제형)
○ CP 특이 박테리오파지의 산업적 응용을 위한 박테리오파지 기반의 시제품 개발
- 개발 결과를 모두 적용하여 박테리오파지 기반의 닭 괴사성장염 예방 및 치료 제제의 시제품을 제작 (액상 및 고상 제제). 고상 제제를 동물모델평가에 활용

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 농림축산검역검사기술개발 연구과제 최종결과보고서 ... 2
• Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 5
• 1. 연구배경 ... 5
• 2. 연구최종목표 ... 6
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 6
• Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 7
• 1. 재 료 ... 7
• 2. 연구전략 및 방법 ... 7
• Ⅲ. 연구결과 ... 9
• 가. 제1 세부과제(국내 괴사성장염 특성조사 및 Clostridium perfringens 특이 bacteriphage 선발) ... 9
• 나. 제2 세부과제: 괴상성장염 평가모델 개발 및 CP 특히 bacteriophage 실용화 ... 15
• Ⅳ. 연구결과요약 ... 24
• 1. 세부과제명: 국내 괴사성장염 특성조사 및 CP균 특이 박테리오파지 선발 ... 24
• 2. 세부과제명: 괴사성장염 평가모델 개발 및 CP 특이 bacteriophage 실용화 ... 25
• V. 고 찰 ... 26
• VI. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 27
• VII. 주요연구 변경사항 ... 27
• VIII. 참고자료 ... 27
• 끝페이지 ... 29