초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
1. 난자 체외성숙 동안 ddC(2',3'-dideoxycytidine)을 이용한 소 난자 mtDNA 제거 기술 개발
○ 도축장에 회수한 소 난소에서 미성숙 난자를 채란하여 난자 체외성숙 동안 각각의 ddC 농도를 처리한 결과, 10μM ddC 처리구에서 약 70% 정도 제2 감수분열 중기 단계까지 체외성숙됨 (Table 1)
○ 난자 체외성숙 동안 10μM ddC를 처리한 후 체외수정하여 수정란의 분할율 및 배반포기까지의 발육율을 검토한 결과,10μM ddC 처리구의 분할율는 대조구와 유의적인 차

Ⅳ. 연구개발결과
1. 난자 체외성숙 동안 ddC(2',3'-dideoxycytidine)을 이용한 소 난자 mtDNA 제거 기술 개발
○ 도축장에 회수한 소 난소에서 미성숙 난자를 채란하여 난자 체외성숙 동안 각각의 ddC 농도를 처리한 결과, 10μM ddC 처리구에서 약 70% 정도 제2 감수분열 중기 단계까지 체외성숙됨 (Table 1)
○ 난자 체외성숙 동안 10μM ddC를 처리한 후 체외수정하여 수정란의 분할율 및 배반포기까지의 발육율을 검토한 결과,10μM ddC 처리구의 분할율는 대조구와 유의적인 차이를 보였지만, 배반포기까지의 발육율은 유의적 차이를 보이진 않았음 (Table 2)
○ 난자 체외성숙 동안 10μM의 ddC 처리한 소 성숙난자 mtDNA 잔여량을 측정하기 위하여 MitoTracker Green FM염색한 결과, Table 3에서 보는 바와 같이 ddC 처리구의 mtDNA 잔여량이 131.7±35.7인 반면 대조구는 262.2±23.3로 유의적으로 감소되었으며, 덧붙여 체외수정 유래 배반포기 수정란 mtDNA 잔여량을 측정한 결과, Table 4에서 보는 바와 같이 ddC 처리구 (294.0±50.7)가 대조구 (586.7±48.5)에 비해 mtDNA 잔여량 유의적으로 감소됨
○ 난자 세포주기 단백질 활성화에 의한 희소한우핵이식 수정란 생산효율 증진
- 소 난자 내 세포주기 단백질 (MPF) 활성화 증진 기술 개발
- 체세포복제 기술을 이용한 희소한우 복제산자 생산
2. 핵이식 공여세포에 적합한 유도만능 줄기세포 (iPS) 생산 및 구축
- Reprogramming 인자로 구축되어진 미니한우 유도만능 줄기세포 (iPS) 구축
- 미니한우 유도만능 줄기세포 (iPS)에 적합한 배양조건 확립
- 유도만능 줄기세포 기능 분석 및 전능성 유전자의 발현 양상 확인
- 유도만능 전능성 줄기세포를 공여세포로 이용한 희소한우 핵이식 수정란 생산 효율성검사 (SB-216763를 이용한 G0/G1 동기화)
3. 핵이식 공여세포에 적합한 초기화유도 전능성 줄기세포 생산 및 구축
○ 희소한우 초기화유도 (AID) 전능성줄기세포 구축 (Fig 6,7,8)
○ 초기화유도 유전자 기능 분석 및 전능성 유전자의 발현 양상 확인 (Fig 9,10)
○ 초기화유도 전능성줄기세포를 공여세포로 이용한 희소한우 핵이식 수정란 생산 효율성검사 (Table 5)
4. 희소한우 초기화유도 전능성 줄기세포 구축 및 줄기세포 특성 검사
○ 희소한우 초기화유도 복수 유전자 (AID, TDG) 발현 2A 벡터 구축
○ 초기화유도 유전자 희소한우 체세포 전이 후 콜로니 형성과 AP 검사
- 초기화 복수유전자를 희소한우 체세포에 전이 후 벡터만 전이한 경우보다 AID 벡터와 AID+TDG 벡터를 전이한 경우가 클로니 형성 및 AP 염색이 유의적으로 증가됨
○ 희소한우 초기화유도전능성줄기세포 초기화 및 전능성 유전자 발현 분석
- 초기화 복수유전자가 삽입된 벡터를 희소한우 체세포에 전이시킨 후 초기화 유전자(AID, TDG) 및 전능성 유전자(Oct4, Sox2, Nanog) 발현을 RT-PCT 및 qPCR로 분석한 결과, 대조구, 벡터만 전이시킨 처리구보다 AID 및 AID+TDG 벡터를 전이시킨 처리구에서 유전자 발현 양상이 유의적으로 증가됨
○ 희소한우 초기화유도전능성줄기세포 초기화 및 전능성 유전자 단백질 발현 검사
- 초기화유전자(AID, TDG)와 전능성유전자(Oct4, Sox2, Nanog) 발현을 형광면역 방법을 이용하여 검사한 결과, 아래 그림에서 보는 바와 같이 AID 벡터가 전이된 AID와 AID+TDG 벡터를 전이시킨 처리구에서 모두 발현되었으며, TDG는 오직 AID+TDG 처리구에서만 발현되었음. 또한, Oct4,Sox2는 AID 및 AID+TDG 벡터가 전이된 처리구에서 발현되었으나, Nanog는 모든 처리구에서 발현되지 않았음
○ 초기화유도전능성줄기세포 특이적 줄기세포 표면인자 단백질 발현 검사
- 특이적 줄기세포 표면인자 (SSEA-1, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81) 단백질 발현을 형광면역 방법을 이용하여 검사한 결과, 아래 그림에서 보는 바와 같이 SSEA-4는 AID 와 AID+TDG 벡터가 전이된 세포에서 발현되었으며, Tra-1-81 단백질은 AID+TDG 유전자가 삽입된 벡터 처리구에서만 발현되었음
5. 희소한우 배반엽상층 유래 줄기세포 구축 및 줄기세포 특성 검사
○ 희소한우 수정란 배반엽상층 유래 줄기세포 구축, 체외배양 (Fig. 13) 및 passage 이후 군집형성 검사
- Fig. 14에서 보는 바와 같이 Accutase, CollagenaseIV, Dispase, CollagenaseIV&Dispase 혼합처리구는 manual picking과 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 0.05% Trypsin-EDTA 처리구와는 AP 염색이 유의적으로 감소됨
○ 배반엽상층 유래 줄기세포 동결/해동 후 Y-27632(ROCK inhibitor) 처리가 줄기세포 군집형성에 미치는 영향 검사
- Fig. 15에서 보는 바와 같이 plating 효율성은 각각의 처리구에서 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 줄기세포형성에서는 STEM CELL BANKER와 DMSO+SERUM 처리구에 Y-27632를 혼합 처리하였을 때 유의적으로 증가하는 것이 관찰됨
- Fig. 16에서 보는 바와 같이 세포사멸 억제자 Y-2763을 연속적으로 처리할 경우 배반엽상층 유래 줄기세포 군집 형성율이 유의적으로 증가함이 관찰됨
6. 희소한우 및 백한우(체세포복제 포함)의 염색체 핵형 및 성장단계별 Telomeric DNA 함량 분석
1) 희소한우 및 복제백한우의 염색체 핵형 분석결과
희소한우 및 복제백한우를 포함하는 백한우의 염색체 이상 유·무검사결과는 Figure 17과 같았다. 50개의 중기 상을 핵형분석 한 결과, 일반한우(A)와 비교해 희소한우 뿐만아니라 복제한 백한우(E) 개체군 모두 정상 2n=60, XY의 염색체를 확인하였다.
2) 희소한우 및 복제백한우의 성장단계별 Telomeric DNA 함량 분석결과
희소한우 및 복제백한우를 포함하는 백한우의 혈액세포(백혈구)의 Telomeric DNA 함량의 분석 결과는 Figure 18과 같다. 먼저, 일반한우 및 희소한우의 염색체 간기상의 백혈구 세포의 핵내 telomeric DNA 발현 양상을 확인 하였다. 또한 IQ-FISH 방법을 이용한 interphase cell상에 telomeric DNA의 상대적 분포율은 일반한우(1.87±0.05)과 칡소(1.86±0.15)간에는 비슷한 양상을 확인하였다. 흑우(1.74±0.11), 백한우(1.67±0.11) 그리고 복제백한우(1.60±0.05)군은 일반한우군과 비교해 telomeric DNA 함량이 상대적으로 낮은 결과를 얻었다.

Abstract ▼

Roslin cloning team has reported the birth of a live lamb from cultured cells which were established from adult tissues and this report paved the way for the subsequent development of offspring using cells derived from differentiated cells. Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is now a well establis

Roslin cloning team has reported the birth of a live lamb from cultured cells which were established from adult tissues and this report paved the way for the subsequent development of offspring using cells derived from differentiated cells. Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is now a well established but inefficient in a range of mammals. Some of the potential applications are based on using SCNT technology to produce cloned animals,but the major applications are likely to be based on nuclear transfer from genetically modified somatic cells so that the cloned embryos and offsprings carry the desired versions of genes. Apparently, the use of SCNT clones in restoring endangered species is perceived to have benefit for livestock industry.
The presence of MPF kinase in the cytoplast recipient induces NEBD and PCC. There events may be important in nuclear reprogramming and development SCNT embryos.Treatment with caffeine, a protein phosphatase inhibitor, increased the activities of MPF in oocytes and additionally resulted in a significant increase in development of SCNT embryos at the blastocyst stage. Also, the technique of SCNT can result in the production of embryos heteroplasmic for mtDNA. This may be detrimental to both the development and health of the resultant offspring. Cytoplast recipients were depleted of mtDNA by treatment of ddC. mtDNA depletion did not affect maturation of oocytes and development of parthenogenetic or IVF embryos.
Activation-induced cytidine deaminase (AID) is the only enzyme that has been suggested as a putative DNA demethylase in mammalian. However, very little is known about AID function as DNA demethylase of bovine differentiated cells toward pluripotency state. To investigate the effect of AID on DNA demethylation, bovine AID complementary DNAs(cDNAs) were transfected into bovine differentiated cells which were mostly methylated in the promoter regions of pluripotency genes. As results, AID transfected bovine cells started to transform into colonies at Day 19 of transfection. The colonies derived from the transfected cells showed positive alkaline phosphatase (AP) staining, and expressions of pluripotency genes (OCT-3/4, NANOG, SOX2) and pluripotency-related antigens (SSEA-4,TRA1-60, TRA1-81) which have been widely used to characterize mouse or human embryonic stem (ES) cells. In particular, the levels of OCT-3/4 and NANOG expression were significantly increased in the AID transfected cells when compared to the control and empty vector transfected cells (p<0.05). Finally, DNA demethylation in the promoter regions of pluripotency genes (OCT-3/4, NANOG) was significantly increased as compared with the control (p<0.05). These results demonstrate that the induction of AID gene in to bovine differentiated cells improves DNA demethylation and expression of pluripotency genes.