보고서 정보
주관연구기관 |
한국생명공학연구원 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2016-02 |
과제시작연도 |
2015 |
주관부처 |
농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 |
TRKO201600003267 |
과제고유번호 |
1395041657 |
사업명 |
국책기술개발 |
DB 구축일자 |
2016-06-25
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201600003267 |
초록
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Ⅳ. 연구개발결과
○ 버섯 유래의 신규 렉틴 분리 정제 및 버섯에 존재하는 당단백질의 확인
- 식용버섯 5종(노루궁뎅이버섯, 표고버섯, 느타리버섯, 팽이버섯, 양송이버섯)으로부터 당단백질에 결합하는 렉틴규명
- 식용버섯에서 당단백질을 분석을 통하여 Man7~Man12의 high mannose 형태의 당을 갖는 N-linked glycan 확인
○ 노루궁뎅이 버섯 유래의 신규 시알산 결합렉틴 분리 정제 및 클로닝
- Fetuin-agarose column을 이용하여 시알산에 선택적인 결합을 하는 노루
Ⅳ. 연구개발결과
○ 버섯 유래의 신규 렉틴 분리 정제 및 버섯에 존재하는 당단백질의 확인
- 식용버섯 5종(노루궁뎅이버섯, 표고버섯, 느타리버섯, 팽이버섯, 양송이버섯)으로부터 당단백질에 결합하는 렉틴규명
- 식용버섯에서 당단백질을 분석을 통하여 Man7~Man12의 high mannose 형태의 당을 갖는 N-linked glycan 확인
○ 노루궁뎅이 버섯 유래의 신규 시알산 결합렉틴 분리 정제 및 클로닝
- Fetuin-agarose column을 이용하여 시알산에 선택적인 결합을 하는 노루궁뎅이버섯의 렉틴 HEL1, HEL2, weakly binding putative lectin을 정제함.
- 정제된 렉틴의 N-terminal sequence 3종 규명을 통해, Weakly binding putative lectin을 aspartic peptidase A1 (Identity: 83%)로 확인함.
- HEL1 유전자를 degenerated primer와 PCR을 이용하여 cDNA 코딩 유전자 증폭, 클로닝함. BLAST search를 통한 조사에서 HEL1 코딩 유전자와 유사한 단백질은 NCBI database에서 확인되지 않음(신규 렉틴일 가능성이 높음).
○ 구멍장이 버섯 유래의 재조합 PSL1b 렉틴 확보
- 선행연구에서 확보된 구멍장이버섯의 PSL1b 렉틴의 유전자를 이종숙주에서 발현하기 위해 유전자의 재설계를 통해 코돈 최적화, RNA 2차 구조 최적화 등을 통해 화학적으로 유전자를 합성함. 합성된 유전자의 대장균에서 발현을 통해 재조합 렉틴을 대량으로 생산할 수 있는 균주 확보함.
○ 효모발현 시스템을 이용한 시알산 당사슬 결합 안정적 생산 기반 구축
- 메탄올 자화효모 Pichia pastoris 기반의 단백질 발현 시스템 구축을 통해 구멍장이버섯 유래의 재조합 PSL1b 렉틴의 안정적 생산 기반 구축
- 1.5 L Jar fermentor에서 fed-batch culture 방법으로 limited glycerol feeding, 메탄올, pH, pO2 등의 조절을 통해 재조합 PSL1b 렉틴이 포함된 단백질을 최종 60 mg/L 이상으로 분비 발현 생산함.
- 재조합 PSL1b 렉틴을 ammonium sulfate 침전, affinity column (HiTrap FF), gel filtration column (Superose 12)를 이용한 분리 기술 확보
○ 노루궁뎅이버섯 유래의 렉틴의 최적 분리 정제 기술 개발
- 활성형의 HEL1 렉틴을 확보하기 위해 노루궁뎅이버섯 자실체로부터 ammonium sulfate 침전, dialysis, DEAE-Sepharose column, Fetuin-agarose column, Superose 12 column의 연속적인 정제를 통한 최적분리 기술 확보
- 상기의 정제 방법을 통해 순수 정제된 약 15 kDa HEL1과 약 75 kDa의 HEL2 렉틴 확보
- N-말단서열 및 단백질 MS 분석을 HEL1 렉틴이 HEL1a와 HEL1b의 isolectin으로 존재하는 것을 규명
○ 신규 버섯 렉틴의 생화학적 특성 규명
- MS 분석을 통해 재조합 PSL1b 렉틴은 37943.56 Da, native HEL1a와 HEL1b 렉틴은 각각 15327.587Da과 15536.953Da 그리고 HEL2는 73253.12 Da으로 확인됨.
- Non-denaturation condition에서는 각 렉틴은 dimer 형태이며 PSL1b는 약 75 kDa과 HEL1은 약 32 kDa 이었으며, pI는 4.3과 4.5으로 확인됨.
- PSL1b 렉틴은 rabbit/chicken RBCs에 HEL1 렉틴은 porcine/ rabbit/chicken RBCs에 대해 hemagglutination activity를 확인하였으며, 특징적으로 HEL1은 porcine RBCs에 강한 활성이 측정되어, 향후 NeuGc 당사슬 측정에 활용될 가능성이 있는 것으로 예상함.
○ Glycan array를 이용한 렉틴의 당사슬 결합 특이성 측정
- Alexa Fluor 488로 형광 라벨링한 PSL1b와 HEL1 렉틴을 미국 CFG의 glycan array를 활용하여 당사슬 결합 특이성을 확인함.
- PSL1b는 460여개의 당사슬 중에 196개의 당사슬에 반응 했으며, 이중 α(2→6) 시알산 (NeuAc)을 포함하는 6개의 당사슬에 대해 강한 시그널이 관찰됨.
- HEL1는 100개의 당사슬에 반응했으며, 이중 NeuAc를 포함하는 α(2→3) 결합의 core 1 O-linked glycan을 구조를 포함하는 33개의 O-linked glycan 당사슬에 높은 결합력을 나타남.
- PSL1b와 HEL1 렉틴 모두 시알산 특이적 결합을 하는 것으로 확인됨.
○ 시알산 결합 특이적인 렉틴의 응용 기술 개발 연구
- 렉틴을 이용한 시알산 당사슬이 부가되어 있는 당단백질 측정을 위한 lectin blot analysis를 통한 시알산 부가 당단백질 확인함.
- 형광 표시를 통한 신규 렉틴을 이용하여 CHO-K1 세포 표면에 존재하는 시알산 당사슬 포함 당구조의 결합을 통해 형광이미지 분석법을 개발함.
- Core 1 O-linked glycan의 구조에 결합력을 갖는 HEL1 렉틴의 특성을 기존 개발된 PNA 렉틴과 특성 비교를 통해 특이성 규명함.
Abstract
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Mushrooms are potential resources to find glycan-specific binding proteins, lectins, which are powerful tools for analysis and isolation of glycoconjugates in organisms. In this study, we identified novel lectins from an edible mushrooms Hericium erinaceum and Polyporus squamosus for detection of si
Mushrooms are potential resources to find glycan-specific binding proteins, lectins, which are powerful tools for analysis and isolation of glycoconjugates in organisms. In this study, we identified novel lectins from an edible mushrooms Hericium erinaceum and Polyporus squamosus for detection of sialoglycoconjugates. A lectin, HEL1, was purified from the mushroom fruiting body of H. erinaceum by a combination of ion exchange on DEAE-Sepharose, affinity on fetuin-agarose, ion exchange on Q-sepharose, and size-exclusion chromatography on Superose 12. Gel filtration chromatography, Tricine-PAGE and N-terminal amino acid sequencing indicated that the native HEL1 is composed of two identical 15-kDa subunits associated by non-covalent bonds. The cDNA cloning revealed that HEL1 contains a ricin B chain-like (QxW)3 motif at its amino acid sequence. The carbohydrate binding properties of the purified HEL1 lectin showed higher specificities and affinities toward core 1 O-glycan as well as sialylated core 1 O-glycan in the glycan microarray containing 460 glycoconjugate structures.
In addition, we functionally produced a recombinant lectin of the mushroom Polyporus squamosus. The mushroom fruiting body of P. squamosus has isolectins, PSL1a and PSL1b, with specificities for sialylated glycoconjuages containing Neu5Acα2,6Galβ 1,4GlcNAc/Glc. A recombinant PSL1a lectin was expressed in Escherichia coli as a fully active, soluble form, whereas a recombinant PSL1b lectin was obtained as aggregated from. In this study, to study the functional analysis of PSL1b isolectin, the lectin-coding gene was expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris with the Saccharomyces α-factor sequence. The yeast secreted directly the recombinant protein via the secretory pathway into the culture medium. Approximately 10 mg of recombinant lectin was purified per liter medium by a bioreactor cultivation. The recombinant PSL1b lectin was about 36 kDa protein within mannosylated N-glycans. The glycan binding analysis clearly showed that the recombinant PSL1b lectin interacts with α2,6-linked sialoglycoconjugates in the glycan microarray.
Moreover, these sialic acid binding lectins, HEL1 and PSL1b, were applied to lectin blot analysis for evaluation of glycan-linkages in a glycoprotein and to cell fluorescence imagining analysis harboring sialoglycoconjugates on cell surfaces. Finally, the lectin blot analysis and the cell imaging analysis render these sialic acid-specific binding mushroom lectins valuable tool for glycobiology and glycobiotechnology as an emerging technology.
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