초록 ▼

Ⅴ. 연구개발결과
1. Latex 채취 및 고무입자 분리
- 천연고무 생합성은 rubber particle 표면에서 일어나는 것으로 추정 되고 있다. 본 연구의 주요 과제는 천연고무 생산에 영향을 주는 유용 유전자들을 분리 동정하는 것이다. 이러한 목적을 달성하기 위하여 말레이시아 및 캄보디아에서 채취한 latex를 세층으로 구분하였으며 고무입자에 붙어 있는 단백질들을 파악하기 위하여 PAGE gel에서 분리하였다.
2. 고무입자에서 천연고무 생합성 관련 단백질 분리
- Latex에서 rubber particl

Ⅴ. 연구개발결과
1. Latex 채취 및 고무입자 분리
- 천연고무 생합성은 rubber particle 표면에서 일어나는 것으로 추정 되고 있다. 본 연구의 주요 과제는 천연고무 생산에 영향을 주는 유용 유전자들을 분리 동정하는 것이다. 이러한 목적을 달성하기 위하여 말레이시아 및 캄보디아에서 채취한 latex를 세층으로 구분하였으며 고무입자에 붙어 있는 단백질들을 파악하기 위하여 PAGE gel에서 분리하였다.
2. 고무입자에서 천연고무 생합성 관련 단백질 분리
- Latex에서 rubber particle를 분리한 다음 rubberㅣ particle에 붙어있는 단백질들을 detergent를 사용하여 떼어 내었다. 그 단백질 중에 천연고무 생합성과 관련된 단백질을 분리하기 위하여 여러 가지 다른 column을 사용하였다. Gel chromatography로 단백질 크기별로 분리하고 ion exchange column을 거쳐 몇 개의 단백질만 남을 때까지 고무 생합성 in vitro activity assay에서 activity를 추적하여 좁혀갔다. 몇 개의 단백질을 전기영동으로 분리하여 partial amino acid를 확보하였다. rubber particle 고무입자에 붙어있는 단백질을 degergent를 처리하여 분리하고 추출한 다음 천연고무 생합성 in vitro assay를 통하여 생합성활성을 추적하였다. size fraction chromatography 등 여러 columns을 통과하여 최종 남아있는 단백질들을 MALDI-TOF로 동정하였다.
3. Latex 조직에서 RNA sequecing 및 Transcriptome 분석
◦ 다양한 러시아 민들레 조직으로부터의 RNA sequencing
- 러시아 민들레의 잎, 뿌리, 2개의 다른 라텍스 sample로부터 얻은 RNA sample을 사용하여 Illumina sequencing을 수행하였다.
- HiSeq 2000 system을 사용하여 약 14.9 Gbp의 sequence 정보를 얻었다.
- 이러한 raw read들은 assemble된 sequence의 질을 개선하기 위해 양쪽 끝의 low-quality base의 제거 과정을 거쳤다.
- SolexaQA package에 있는 DynamicTrim과 LengthSort 프로그램을 사용하여 trim과 sort 작업을 수행하였다.
- 최종적으로 전체 read 중, 85%에 해당하는 125,492,878 reads (10,953,646,408 base)가 high-quality read로 분류되었다.
◦ De novo assembly를 통한 전사체 선별
- de Bruijn graph 알고리즘을 기반으로 하는 Velvet과 Oases를 사용하여 trimmed reads를 전사체로 de novo assembly를 수행하였다.
- 다양한 hash length 값 중, k-mer=59와 k-mer=61을 사용하여 de novo assembly 후, k-mer=61을 사용하여 최종적으로 assembly를 수행하였다.
◦ 라텍스에서 발현되는 unigene 선발
- 42,203개의 전체 unigene 중, 라텍스에서만 발현되는 unigene을 선발하기 위해 raw read 수가 5개 미만인 unigene을 제외함으로써 37,412개의 unigene을 선발하였다.
◦ Annotation 분석
- 37,412개의 라텍스 발현 unigene에 대해 Gene Ontology (GO), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), Clusters of orthologous groups for eukaryotic genome (KOG)의 annotation 분석을 수행하였다.
4. 전사체 분석을 통한 고무생합성 관련 유전자군 분리와 발현양상 조사
- 총 39개의 고무생합성 관련 유전자를 동정하였다. MVA 경로 (mevalonate pathway) 13개 유전자, MEP 경로 (2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate pathway) 11개 유전자, 하위 경로(Downstream) 7개 유전자, 고무생합성 관련 (Rubber biosynthesis) 8개 유전자를 각각 동정하였다.
◦ 고무생합성 관련 유전자들의 발현양상 조사
- 제작한 primer를 사용하여 39개의 고무생합성 관련 유전자들에 대해 발현양상을 조사하였다.
- CFX96 Real-time PCR detection system (Bio-Rad)을 사용하여 quantitative real-time RT-PCR(qRT-PCR)을 수행하였다.
- TkActin1을 reference로 사용하여 normalization 후, 결과값을 얻었다.
- qRT-PCR을 통해 발현이 나타나지 않은 5개 유전자는 제외하였다.
- MVA 경로 유전자들의 발현이 MEP 경로 유전자들의 발현보다 대체로 높게 나타났다.
- 고무생합성 유전자들 중, TkSRPP3, TkSRPP5, CPT1의 발현은 매우 높게 나타났다.
5. 고무 생합성 효소 후보 유전자 전체서열 cloning 및 재조합 단백질 생산
- RNA-sequencing database를 바탕으로 확보한 부분 peptide 서열정보를 이용하여 예시와 같이 고무생합성효소 유전자를 확보하였다.
- 단백질 발현 백터를 제작한 후 대장균과 이스트에서 재조합 단백질을 발현 정제하였다.
- Hevea에서 분리한 천연고무 생합성 후보 단백질의 항체를 제작하였다.
6. 고무 생합성 후보 단백질의 in vitro 활성 검정과 특허출원
- Hevea에서 latex를 수확한 후 ultracentrifuge하여 rubber particle 층, C-serum 층, 및 bottom fraction으로 구분 그리고 immno-precipiation한 후 Western blot으로 고무생합성 후보 단백질의 발현을 조사하였다.
- 상기한 고무 생합성 재조합 단백질을 가지고 in vitro assay를 수행하였는데 천연고무 생합성단백질이 막 단백질인 관계로 추출 정제하는 데 많은 어려움을 겪었으며 활성이 보이지 않았다.이러한 어려움을 극복하기 위하여 antibody(항체)를 제작하여 immuno-precipitation(IP)을 시도하였으며, IP한 단백질로 in vitro assay를 수행하여 후보 단백질이 고무 생합성의 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
- 활성을 검정한 고무 생합성 후보 단백질과 유전자 서열을 특허출원하였다. 곧 이어 PCT특허출원을 진행할 예정이다.
7. 고무 생합성 유전자 promoter sequence cloning
- 파라고무나무 (Hevea brasiliensis)의 잎으로부터 CTAB 용액을 사용하는 분리 방법을 통해 genomic DNA를 추출하였다. 이러한 genomic DNA를 Nanodrop 기기를 사용하여 DNA 농도를 측정 후, 최종농도를 50 ng/μL으로 맞추었다.
- 이전 연구를 통해 밝힌 고무중합효소 후보 유전자인 파라고무나무 Pep16 (HbPep16) 유전자의 DNA sequence를 바탕으로, genomic DNA를 사용하여 inverse PCR을 수행하였다.
- iPCR을 통해 1079 bp의 promoter 영역의 sequence를 얻었으며 이를 sequencing을 통해 확인하였다.
- 고무중합효소 후보 유전자의 promoter에 대한 promoter-GUS 벡터 제작하였다.
8. 유전자 도입 민들레 형질전환체 제조
- 고무중합효소 후보 유전자인 HbPep16에 대한 promoter-GUS 형질전환체 및 latex-specific promoter (SRPP promoter)를 사용한 과발현 형질전환체를 생산하고자 하였다.
- 식물체 절편에서 형성된 캘러스를 사용하여 Agrobacterium tumefaciens과 co- culture를 시킨 후, 적절한 농도의 호르몬과 항생제를 포함하는 선택배지에서 형질전환이 이루어진 캘러스를 선별하였다.
- 이 과정에서 캘러스뿐만 아니라 일부 식물체의 재분화가 유도되었다. 이후 유도된 식물체들을 생장배지에서 완전한 식물체로의 재분화를 위해 생장시키고 있다.
9. 지하부 biomass 생산을 위한 러시안 민들레 대량 재배기술 개발
◦ 재배용 뿌리절편 묘 대량 생산
- 뿌리를 수확 후 바로 절단하여 상토에 심는 것보다 3-4일 건조시킨 후 절단하여 심었을 때 싹이 더 잘 나왔다.
- 상토로 채원진 모판에 3-40개의 뿌리 절편을 심어서 식물공장과 육묘장에서 2개월 정도 재배하였다.
◦ 하우스내 육묘판에서 유묘 재배
◦ 하우스내 육묘판에서 고무추출용 러시안 민들레 재배 및 수확.
- 재배 기간별 정기적인 고무함량 분석에 의한 최적 수확 시기 검토하였다.
- 장기간 재배시 복토에 의한 뿌리 생산량 증가 검토하였다.
- 생장이 왕성할 때 1주 간격으로 25% 메탄올을 뿌려서 잔뿌리 생성 촉진하였다.
- 잎이 거의 고사할 시기에 수확하면 작업이 수월하였다.
- 모판재배는 제초작업이 필요 없어 노지재배보다 재배관리가 편리하였다.
◦ 하우스내 토양에서 멀칭 재배에 의한 대량 생산
- 뿌리절편으로 만든 묘를 토양에 이식하여 러시안 민들레를 대량 재배하였다.
- 이식된 묘는 1개월 재배하였을 때 뿌리가 토양에 완전히 활착시켰다.
- 토양재배는 멀칭해도 잡초가 무성해 3주에 1회정도 잡초제거 필요하였다.
- 여름철 하우스내 고온 장애 방지를 위해 차광막 설치하였다.
10. 러시안 민들레 고무함량에 미치는 메탄올 영향분석 - 러시안 민들레 고무함량에 미치는 화학물질의 영향을 평가하였다.
- 메탄올 또는 메탄올영양박테리아 처리에 의한 고무함량 증가를 발견하였으며 이의 결과를 바탕으로 특허출원하였다.
- 본 발명은 메탄올 또는 메틸로트로픽 박테리아 처리에 의한 식물체의 고무 함량 증가방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식물체에 메탄올 또는 메틸로트로픽 박테리아를 처리하여 식물체의 고무 함량을 증가시키는 방법 및 메탄올 또는 메틸로트로픽 박테리아를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 고무 함량 증가용 조성물에 관한 것이다.
11. 러시안 민들레에서 천연고무 추출방법 개선 - 기존 soxlet 방법에서의 문제점을 발견하고, 이를 보완하여 효율적인 고무추출 방법을 찾고자 하였다. soxlet 방법은 그라인딩 후의 뿌리를 이용하였을 때 뿌리 양이 많아질수록 고무추출의 효율이 떨어졌으며 결과의 반복성이 떨어지는 결과를 보였다. 이 문제를 해결하고자 우리는 뿌리 가루를 cyclohexane에서 24시간 동안 섞어 준 후 고무가 포함 된 cyclohexane만 분리 할 수 있도록 원심분리기를 이용하여 뿌리가루만 제거하였다. 그 후 아세톤을 이용한 응집작용을 통해 고무를 추출하였다. 이 방법은 샘플 양에 상관없이 비슷한 효율로 고무를 추출 할 수 있었으며 매 실험에서 비슷한 결과를 보였다.
- 그라인딩 된 뿌리 사이즈에 따라 고무추출 효율이 달라 질 것이라 예상하고 뿌리 사이즈를 달리 하여 고무를 추출하였다. 실험방법은 overnight soaking 방법을 이용하여 실험을 진행하였다. 뿌리는 총 3가지 형태로 그라인딩하였고, 가장고운가루만 실험용 그라인더를 이용하였고, 나머지는 주방용 그라인더를 이용하여 그라인딩 하였다. 실험결과 뿌리 사이즈가 작을수록 고무추출 효율이 높아지는 것을 확인 하였다.
- 뿌리와 cyclohexane 비율 및 처리 온도에 따른 고무추출 효율을 분석하였다. 뿌리는 4g을 이용하였고 뿌리 g당 cyclohexane 비율은 각각 1:10, 1:20으로 설정하였다. 24시간동안의 shaking은 각각 25℃, 50℃에서 RPM150으로 섞어주었으며, 용매의 증발을 막기 위해 호일로 감싼 후 실험을 진행하였다. 뿌리와 cyclohexane의 비율에 따른 고무추출 효율을 비교하였을 때 1 : 10의 비율에서는 약 8%의 효율을 보였으며, 1 : 20의 비율에서는 약 6%의 효율로 1 : 10의 비율에서 더 좋은 고무추출효율을 보였다. 반면에 온도는 고무 추출 효율에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
12. 러시안 민들레에서 추출한 천연고무의 물리화학적 특성분석
가. 지하바이오 매스 대량 확보 및 천연고무 추출
◦ 지하바이오 매스 대량 확보
- 위탁연구기관 하우스 내 토양에서 재배된 러시아 민들레를 수확(여름 1회, 가을 1회)
◦ 천연고무 추출
- 방법 1 : Soxhlet extraction으로 천연고무 추출
- 방법 2 : 민들레 뿌리를 미세분쇄 후 Cyclohexane으로 녹이고, Cyclohexane의 2배 아세톤을 첨가하여 고무를 침전시켜 고무 추출물을 얻음
나. 추출 천연고무 물성 특성분석
- Heava 고무나무에서 추출 된 천연고무 대비 러시아 민들레에서 추출 된 천연고무를 KS배합에 의해 칭량 후 혼련공정을 거쳐 KS M 6518(가황고무 물리 시험방법)따라 시험을 진행하였다.
◦ 재료
- 본 연구에 사용된 배합 조성표는 Table 1에 나타내었다. Heave 고무나무에서 추출된 천연고무 Grade는 SPR#20를 사용하였으며, 카본블랙은 N330(HAF)을 사용하였다.
- 황 가류를 위하여 촉진제로서는 CBS(N-Cyclohexyl-2benzothiazole sulfenamide)와 황(Sulfur)을 사용하였다. 산화아연, 스테아린산, 오일은 동일하게 적용하였다.
◦ 칭량 및 소련/혼련 작업, 시편제조
- 소련(mastication)은 기계적인 전단력으로 고무 분자쇄를 절단 또는 쇄상 분자의 상호 얽힘을 풀어 분자량을 저하 시키는 작업으로서, 천연고무는 분자량이 크고 일정하지 않으므로 3분이상 충분히 진행하였다.
- 혼련공정은 배합제를 원료고무 중에 균일하게 분산시키는 작업으로서 Brabender OHG社 시험용 Internal Mix를 이용하여 배합제의 첨가순서 및 시간을 동일하게 적용하여 시험을 진행하였다.
- 혼련특성은 일반적으로 소요전력과 혼련시간과의 관계로부터 얻을 수 있다. 고무나무에서 추출된 천연고무와 민들레에서 추출된 천연고무를 동일한 믹싱 시간에서 작업시 시험용 Mix의 Torque와 온도 값이 유사함을 확인 할 수 있었다.
◦ 물성시험
- 미가황고무 시험
: ASTM D1646에 따라 무늬점도 시험결과 Heava 고무나무 무늬점도는 50, 민들레 추출분 천연고무의 무늬점도는 49로 가공성이 유사한 수준임 확인되었다.
: 가황곡선을 이용한 가황상태 분석 결과, 최대 토크값은 유사한 수준이며 스코치 특성은 민들레 추출분 천연고무의 스코치 거동이 빨라지는 것으로 확인 되었다.
- 가황고무 시험
: KS M 6518 (가황고무 물리 시험방법)에 따라 가황고무 물성 시험 결과 경도는 추출분 천연고무의 경도가 3(Shore A) 높음
: 인장강도(kg/cm2), 신장율(%), 내마모성을 종합적으로 비교하면 고무나무 추출분 천연고무 대비 민들레 추출분 천연고무의 가황고무 물성은 90% 수준으로 확인된다. 물성시험결과는 Figure6에 나타내었다.
- Dynamic Mechanical
: 고무의 기계적 물성은 높은 온도에서 약해지기 때문에 열 발생이 적은 Polymer 사용이 바람직하다. GABO사 EPLEXOR 150N 점탄성 시험기를 이용하여 Properties 시험결과민들레 추출분 천연고무가 고무나무 추출분 천연고무 대비 발열 특이 10% 이상 저하됨을 확인 할 수 있었다. 민들레 추출분 천연고무의 동특성능 향상을 위해서는 가교제 함량 증량 외 방법으로 가교제 변경이 필요해 보인다.

Abstract ▼

IV. Results and Application
1. Latex collection and isolation of rubber particle
□ Latex was collected from Cambodia and rubber particles was isolated.
2. Isolation of Functional genes related to rubber biosynthesis
□ Isolation of functional genes related to natural rubber biosynthesis

IV. Results and Application
1. Latex collection and isolation of rubber particle
□ Latex was collected from Cambodia and rubber particles was isolated.
2. Isolation of Functional genes related to rubber biosynthesis
□ Isolation of functional genes related to natural rubber biosynthesis
3. RNA sequencing and transcription analysis in latex
□ Latex RNA of TKS was sequenced and used for transcriptome analysis
4. Identification of rubber biosynthesis pathway genes
□ Rubber biosynthesis pathway genes were isolated from RNA sequencing database.
5. Cloning of rubber biosynthesis genes
□ Seperation of rubber particles and In vitro assay of rubber biosynthesis
□ Functional genes related to improvement of abiotic and biotic stress resistances
6. In vitro assay of rubber biosynthesis genes
□ Rubber biosynthesis-related genes were expressed in vivo and assayed in vitro
7. Cloning of promoter of rubber biosynthesis gene
□ The promoter region of rubber biosynthesis gene was cloned.
8. Transformation of dandelion
□ Generation of transformant dandelion plants that contain functional genes related to natural rubber biosynthesis
□ Generation of transformant dandelion plants that contain functional genes related to increase rubber content and improved growth rate.
9. Techniques for cultivation of Russian dandelion
□ Import of Russian dandelion, cultivation, harvest, extraction of natural rubber, and analysis of natural rubber properties.
□ Comparison of natural rubber properties with native dandelion plants
10. Effect of abiotic stresses or hormones on rubber content
□ The effects of abiotic stresses such as drought or hormones were evaluated.
11. Improvement of rubber extraction methods
□ The rubber extraction methods were examined for further improvement.
12. Characterization of physical chemical properties of TKS rubber
□ Rubber extracted from TKS was examined for its physical/chemical properties in compared to Hevea rubber.