보고서 정보
주관연구기관 |
경북대학교 KyungPook National University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2016-02 |
과제시작연도 |
2015 |
주관부처 |
농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 |
TRKO201600003279 |
과제고유번호 |
1395040973 |
사업명 |
국책기술개발 |
DB 구축일자 |
2016-06-25
|
DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201600003279 |
초록
▼
Ⅳ. 연구개발결과
1. CaGLK2 염기 서열 분석
고추에서 미숙과의 녹색 진하기가 다양한 37계통의 cDNA를 이용하여 CaGLK2 유전자의 염기 서열 차이를 분석하였다. 염기 서열 분석 결과 CaGLK2 유전자에 변이가 생겨 같은 유전형을 갖는 6 그룹을 분리 할 수 있었으며 이들을 각각 판별할 수 있는 HRM 마커를 제작하였다. 또한 미숙과색이 진녹색인 Milyang과 연녹색인 Goshiki의 F2집단에서 유전형을 구별하기 위한 HRM마커도 제작하였다.
2. An2 3’ promoter region 염기
Ⅳ. 연구개발결과
1. CaGLK2 염기 서열 분석
고추에서 미숙과의 녹색 진하기가 다양한 37계통의 cDNA를 이용하여 CaGLK2 유전자의 염기 서열 차이를 분석하였다. 염기 서열 분석 결과 CaGLK2 유전자에 변이가 생겨 같은 유전형을 갖는 6 그룹을 분리 할 수 있었으며 이들을 각각 판별할 수 있는 HRM 마커를 제작하였다. 또한 미숙과색이 진녹색인 Milyang과 연녹색인 Goshiki의 F2집단에서 유전형을 구별하기 위한 HRM마커도 제작하였다.
2. An2 3’ promoter region 염기 서열 분석
미숙과에서 자색의 표현형을 갖는 KC00134와 녹색의 표현형을 갖는 칠복2호를 이용하여 고추에서 자색을 결정하는 유전자인 An2 유전자의 염기 서열을 분석하였다. An2 유전자의 genomic DNA 길이는 1,479 bp 였으며 3개의 exon과 2개의 intron으로 구성되어 있었다. exon의 총 길이는 789 bp로 확인되었다. 하지만 An2 유전자 내에서 자색과 녹색의 표현형을 갖는 고추의 염기서열상 차이는 확인 되지 않았고 추가로 An2 프로모터의 염기서열을 확보하였으며, 자색 고추와 녹색 고추 간의 염기서열 차이를 확인할 수 있었다(Fig. 2). KC00134와 칠복 2호의 염기서열에서는 An2 유전자 뒤쪽 프로모터의 3,739bp 부분에서 Guanine (G) 이 Adenine (A) 으로 변형되는 SNP를 확인할 수 있었다
3. 미숙과색이 연녹색과 자색인 고추 판별을 위한 HRM 마커제작 및 패널 테스트
CaGLK2 유전자의 염기 서열 내 변이와 An2 유전자의 3’ promoter region에서 염기 서열 내 변이를 이용하여 각각의 유전형을 판별할 수 있는 마커를 제작하였다. 이 마커를 이용하여 HRM을 통해 CaGLK2 유전자의 염기 서열 내 변이가 있는 계통과 없는 계통, 자색인 계통과 녹색인 계통의 melt curve 패턴을 비교하였으며 이들의 melt curve 패턴이 상이하여 마커로 사용할 수 있음을 확인하였다. 또한 Milyang과 Goshiki F2집단에서 진녹과 연녹 유전형을 구별하기 위한 HRM 마커를 제작하였다. Milyang의 CaGLK2 유전형은 유전자내에 변이가 존재하지 않았고 Goshiki는 CaGLK2 유전자 내에 변이가 존재하였으며 네 번째 그룹 (PTC-D)에 포함되어 있었다. 이 두 유전형을 구별하기 위한 마커를 제작하여 melt curve 패턴을 분석한 결과 유전형과 표현형이 일치하는 것을 확인할 수 있었다.
4. VIGS 테스트를 통한 An2와 CaGLK2 기능 동정
VIGS 테스트 결과 GFP /An2를 silencing한 개체가 GFP를 silencing한 개체, silecing을 유도하지 않은 개체와 비교하였을 때 식물 전체적으로 자색의 발현이 거의 없는 표현형을 나타내었다. 또한 이들로부터 RNA를 추출하여 qRT-PCR을 수행 한 결과 GFP /An2개체에서 An2의 발현이 다른 개체들보다 현저하게 낮은 것을 확인할 수 있었다. 또한 고추 미숙과색을 조절할 것으로 예상되는 CaGLK2의 기능을 분석하기 위해 An2를 reporter gene으로 하여 GLK2/An2 construct를 만들어 GFP /An2, silecing을 유도하지 않은 개체와 비교한 결과 GLK2/An2 개체가 대조구인 GFP /An2 개체보다 미숙과색에서 연녹색을 띄는 것을 확인할 수 있었다. 이들의 RNA를 추출하여 qRT-PCR을 수행한 결과 GLK2/An2를 silencing한 개체에서 GLK2의 발현량이 대조구보다 낮은 것을 확인할 수 있었다.
5. CaGLK2 유전자 기능 동정을 위한 Real-time PCR 및 HPLC 분석
CaGLK2 유전자의 기능을 동정하기 위해 CaGLK2 유전자 염기 서열 내에 변이가 있는 6 그룹에서 각 그룹을 대표할 수 있는 유전자원을 선발하였다. 대조구로는 CaGLK2 유전자 내에 변이가 없고 표현형이 진녹과 연녹인 유전자원을 사용하였다. Real-time PCR을 통해 여러 유전자원에서 CaGLK2 유전자의 발현량을 확인한 결과 CaGLK2 유전자에 변이가 있고 미숙과가 연녹색인 유전자원들은 대체로 유전자에 변이가 없고 미숙과색이 진녹색인 유전자원보다 CaGLK2의 발현량이 적었다. 하지만 CaGLK2 유전자에 변이가 없고 미숙과에서 진녹을 띄는 TF68, Ancho 또한 CaGLK2 유전자에 변이가 있는 유전자원가 발현량이 비슷한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 CaGLK2는 고추에서 미숙과색을 조절하는 중요한 유전자일 것으로 판단되며 CaGLK2 외에 고추 미숙과색을 조절하는 추가적인 인자가 있을 것으로 추정된다.
같은 유전자원으로부터 chlorophyll과 carotenoid를 추출하여 HPLC 분석을 한 결과 CaGLK2 유전자 염기 서열에 변이가 없고 표현형이 진녹색 유전자원의 경우 예상대로 chlorophyll 함량이 연녹색 유전자원보다 현저히 높았다. 뿐만 아니라 carotenoid인 neoxanthin, lutein, β-carotene의 함량도 진녹색 유전자원이 연녹색 유전자원보다 매우 높은 것을 확인 할 수 있었다. Carotenoid는 고추의 숙과색을 결정하는 중요한 대사산물로써 미숙과가 연녹인 유전자원이 CaGLK2 유전자로 인해 carotenoid 함량이 조절될 경우 이들의 숙과색이나 기능성 대사산물의 합성에도 중요한 영향을 미칠 것으로 예상된다. 이것은 살구색 habanero 에서도 확인할 수 있다. 살구색 habanero는 오렌지색 habanero의 matant로 추정되며 오렌지색 habanero는 CaGLK2 염기서열 내에 변이가 없고 살구색 habanero는 CaGLK2 염기 서열에 변이가 있는 PTC-E 그룹에 속하는 유전형을 가지는 것이 확인되었다. 살구색 habanero는 오렌지색 habanero와 크기, 형태 등의 특징은 모두 유사하지만 미숙과색이 진녹, 숙과색이 오렌지색인 habanero 와는 다르게 미숙과색이 연녹, 숙과색이 살구색인 특징을 갖는다. 또한 고추의 미숙과에서 chlorophyll a, b와 carotenoid compound 함량의 상관관계를 분석한 결과 각각의 compound는 모두 밀접한 정의 상관관계가 있는 것이 확인되었다. 이 결과는 CaGLK2로 인해 chlorophyll 함량이 조절 될 경우 carotenoid 함량 또한 조절될 것이라는 가설을 뒷받침해준다.
Abstract
▼
Pepper is very important crop as financially and dietary. Our country have history about commercial breeding over the 40 years. Especially, competitiveness of pepper breeding technique is the world class. Therefore we have to development high technology that is able to apply breeding directly to mai
Pepper is very important crop as financially and dietary. Our country have history about commercial breeding over the 40 years. Especially, competitiveness of pepper breeding technique is the world class. Therefore we have to development high technology that is able to apply breeding directly to maintain international competitiveness and gain the upper hand. Fruit quality of pepper is decided according to shape, flavor, composition and nutrient. Pepper fruit is repository of second metabolite and contain a lots of functional compound like capsaicinoid, carotenoid, vitamin C, vitamin E. These compound already studied to identify biosynthesis pathway and decomposition pathway in many crops and correlate with gene expression regulating functional compound. The SNP or INDEL mutation is stable to related gene expression at various environment than QTL thus can use to breeding directly. The chlorophyll, carotenoid (lutein, β-carotene, capsanthin) and flavonoid (anthocyanin) is concerned in fruit color of pepper. During fruit ripening, chloroplast was converted to chromoplast and carotenoid and flavonoid is synthesized. Carotenoid related with yellow, orange, red color of pepper fruit and flavonoid related with purple color of pepper fruit. The study about mechanism of fruit color in pepper is focused at mature fruit however study about regulating mechanism of immature fruit is insufficiency.
To identify regulating mechanism about immature fruit color of pepper, function of An2 ,known anthocyanin regulate gene, and GLK2 ,known chloroplast regulate gene, was investigated. Sequence of An2 and CaGLK2 verified using various purple and light green pepper, Many germplasms have allelic variation at GLK2 and An2 sequence. Therefore, we made 6 marker for identify CaGLK2 variation and 1 marker for identify An2 using HRM. That makers are able to distinguish efficiently purple pepper with green pepper and light green pepper with green pepper. VIGS is useful tool for identify functing of gene in plant. Using pepper appearanced purple color in all tissue, GFP and GFP /An2 gene was silenced. These phenotype showed significantly difference in all tissue. The WT and GFP silenced plants showed purple color however GFP /An2 silenced plants showed green color. In qRT-PCR, An2 level was lower at GFP /An2 than WT and GFP silenced plants. In order to demonstrate GLK2 function, GFP /An2 and GLK2/An2 was silenced in purple pepper. Immature fruit color of GFP /An2 showed green color but GLK2/An2 silenced plants showd light-green color at immature fruit. Additional experiment was conducted to investigate function of CaGLK2. Expression of CaGLK2 was anlayzed in pepper germplasms. The level of GaCLK2 expression lower in light-green peppers lower than green pepper. However expression level of some green pepper was similar with light-green pepper. Therefore Using these pepper, chlorophyll and carotenoid was extracted and analyzed by HPLC. The light-green peppers were rarely contained chlorophyll and carotenoid. And chlorophyll with carotenoid was significantly correlated. Thus, CaGLK2 is a main factor of regulating chlorophyll and carotenoid contents. Also, it is assumed that there are another factors related to immature fruit color of pepper.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.