초록 ▼

Ⅴ. 연구개발결과
1. 위축성 비염과 파스튜렐라 폐렴 예방 생균 다가 백신 개발을 위한 주요 병원성 인자 항원발굴 및 유전자 확보
1) 위축성 비염 유발 병원균 (Pasteurella multocida type D, Bordetella bronchiseptica) 및 파스튜렐라 폐렴 (Pasteurella multocida type A)
▸ 돼지에서 위축성 비염은 대부분의 양돈장에 상재하는 돼지의 만성 호흡기 질환으로 비강에 침입한 Bordetella bronchiseptica와 Pasteurella multocid

Ⅴ. 연구개발결과
1. 위축성 비염과 파스튜렐라 폐렴 예방 생균 다가 백신 개발을 위한 주요 병원성 인자 항원발굴 및 유전자 확보
1) 위축성 비염 유발 병원균 (Pasteurella multocida type D, Bordetella bronchiseptica) 및 파스튜렐라 폐렴 (Pasteurella multocida type A)
▸ 돼지에서 위축성 비염은 대부분의 양돈장에 상재하는 돼지의 만성 호흡기 질환으로 비강에 침입한 Bordetella bronchiseptica와 Pasteurella multocida type D에 의해 비강 점막에 염증을 일으키고 비갑개골과 상악골이 위축되고 코가 비뚤어지는 질병으로 어린 일령의 자돈이 쉽게 감여된다. 파스튜렐라 폐렴은 P. multocida type A에 의해 감염되어 장거리 수송, 심한 온도 변화, 스트레스 등 저항성이 감소되면 심한 폐렴 증상을 나타낸다. 이 위축성 비염 및 파스튜렐라 폐렴을 유발하는 병원균의 adhesin 및 독소가 면역원성과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 이들 adhesin 및 독소를 중심으로 그 유전자를 확보하였다.
▸ 면역원성과 관련된 주요 adhesin 및 독소들
1) Pasteurella multocida type A 및 D와 관련된 면역원상 인자 CP39, FimA, PtfA, Pm1665, ToxA
2) Bordetella bronchiseptica와 관련된 면역원성 인자 F1, P2
2. 특정 유전자가 제거된 점막면역 활성 delivery system을 이용한 위축성 비염 및 파스튜렐라 폐렴 동시 예방 생균 다가 백신 개발
특정 병원성 유전자가 제거된 점막면역 활성 delivery system 및 vector를 이용한 위축성 비염 및 파스튜렐라 폐렴 예방을 위한 생균 다가 백신을 개발하였다.
1). lon 유전자 및 cpxR 유전자가 결실되어 약독화된 살모넬라 티피무리움(Salmonella thyphimurium) 제조.
살모넬라 티피무리움 야외균주 JOL401의 염색체 DNA를 주형으로 하여, lon 유전자의 5` 말단과 3`말단 부분을 각각 lon-F-XbaI와 lon-R-XhoI 및 lon-F-XhoI과 lon-R-XbaI를 프라이머로하여 PCR법으로 증폭시켜 lon 유전자를 제외한 이들 유전자의 5`말단 및 3` 말단에 연결된 DNA를 증폭하였다. 상기 PCR 반응으로 증폭된 유전자 단편을 각각 클로닝 한 뒤 제한효소 XhoI로 절단하고 라이게이션하여 lon 유전자가 결실된 유전자서열을 얻은 후, 자살 벡터(suicide vector) pMEG375에 클로닝하여 pBP295를 얻었다.
2). 위축성 비염 및 파스튜렐라 폐렴 동시 예방 생균 다가 백신 개발
후보항원 : PM1665, CP39, PtfA, FimA, ToxA, F1-P2
각 후보 항원 (PM1665, CP39, PtfA, FimA, ToxA, F1-P2)을 pBP244를 이용하여, 살모넬라 티피무리움 전달 시스템에 클로닝한 후 항원의 발현 및 분비 여부를 웨스턴 블롯으로 확인하여 각 정제 플라스미드를 전기청공법에 의하여 JOL912에 형질전환시켜 PM1665, CP39, fimA, ptfA, toxA, F1-P2를 발현하는 균주를 얻었다.
3. 백신의 효능을 향상시킬 점막 면역에 효과적인 adjuvant 개발
점막변역을 강화할 수 있는 adjuvant를 개발하여 그대로 백신과 혼합하여 사용하여 마지막 백신 접종 후 3주 후에 야외분리주롤 challeneg 한 후 폐사 여부 및 호흡기 질병 발생 유무로 adjuvant의 효능을 최종적으로 결정하였다.
4. 해당 단백 항원 확보
1) 돼지에서 위축성비염과 파스튜렐라 폐렴 원인균인 Pasteurella multocida type A 및 D와 관련된 면역원상 인자 CP39, FimA, PtfA, Pm1665, ToxA 그리고 Bordetella bronchiseptica와 관련된 면역원성 인자 F1, P2를 대상으로 하여 cloning을 수행하였다.
2) 각 해당 단백 항원 확보
시판되는 발현용 vector (pQE series와 pET28a)와 host (E. coli TOP10과 E. coli BL21)를 이용하여 각 해당 유전자를 발현용 vector에 삽입한 후 해당 host에 transformation 시켜 단백 항원 발현 균주를 확보하였다.
3) 각 해당 항원에 대한 항혈청 확보
1주일 정도의 적응 기간을 거친 약 2Kg 정도의 암컷 New Zealand white rabbit에 위에서 준비된 각 adhesin 항원이 200㎍이 되도록 멸균 PBS로 희석 한 후 Freund's complete adjuvant와 동량 혼합하여 피하 접종하였다. 1차 접종 14일 후에 동량의 항원을 Freund's incomplete adjuvant와 같은 방법으로 혼합하여 피하 접종하여 boosting 하였다. 2차 접종 후 14일째에 채혈하여 혈청을 분리한 다음 -70℃에 보관하며 각 adhesin 항혈청으로 사용하였다.
5. In vitro 상에서 개발된 백신 균주의 발현여부 확인
제작된 백신 균주가 해당 fimbriae을 세포 밖 Outer membrane protein; OMP으로 발현하는지를 확인하기 위하여 SDS-PAGE한 다음 WEST-oneTM Westerm Blotting System(Intron Biotechnology, Korea)으로 발색하여 각 항원의 Size( CP39는 39kDa, fimA는 36kDa,ptfA는 18 kDa, toxA은 22kDa 그리고 F1P2는 27kDa )를 보아 ( CP39, fimA, ptfA, toxA,F1P2 )항원 발현 Salmonella delivery bacterial ghost 백신의 세포 외막에서의 발현 여부를 확인하였다.
6. 실험동물에서의 위축성 비염 및 파스튜렐라 폐렴 예방 각각의 생균 백신 후보균주의 안전성 및 면역 유도 실험
경구접종과 비강접종을 비교하기 위하여, 각각 2회 접종 후 정기적으로 각 항원에 대한 면역반응을 혈청, 질 분비물을 대상으로 IgG 및 sIgA에 대한 항체 역가를 측정하였다. IgG는 마우스에 경구 및 비강접종 후에 각 항원에 대해 형성된 항체의 역가를 측정하기 위한 목적으로 마우스 혈청에서 측정이 되었으며 ELISA로 IgG의 역가를 측정하였다. sIgA는 마우스에 접종한 후에 형성된 mucosal 및 systemic immune response 중 mucosal immune response를 확인하기 위한 실험으로 질 세척액을 대상으로 하여 ELISA로 sIgA의 역가를 측정하였다.
7. 실험동물에서 위축성 비염 및 파스튜렐라 폐렴 예방 생균 백신후보균주의 혼합 접종 실험
백신접종 경로로 비강접종을 선택한 뒤 개별 항원 유전자가 각각 삽입된 약독화Salmonella Typhimurium 백신 균주의 combination 접종에 따른 각 항원에 대한 면역반응 유도와 접종 후 폐에서의 회복 여부를 조직학적으로 확인하여 보았다. 먼저 개별항원에 대한 면역반응으로는 각 항원의 혼합 접종 시 IgG의 경우 모든 항원 즉, CP39, ToxA, PtfA, FimA, F1P2에 대한 IgG는 백신접종 후 2주차부터 8주차까지 항체역가가 유지가 되었으며 sIgA의 경우에는 백신 접종군에서 ToxA, PtfA 항원은 접종 후 2주차에 증가되어 4주차에 가장 높게 증가되어 6주차까지 유지하였다. 항원 CP39, FimA에서는 2주차에 증가하여 4주차에 가장 높게 증가되었다가 항체역가가 떨어졌으며 항원F1P2의 경우 4주차에 증가하여 6주차에 항체역가가 떨어짐이 관찰되었다. 이 결과로 각 백신균주 항원을 종합하여 접종 하였을 경우에도 각 항원에 대해 점막면역반응이 유도됨을 확인할 수 있었다. 각 항원의 유전자가 삽입된 약독화된 살모넬라의 백신후보주와 대조군에서 백신접종 뒤 면역유도와 밀접하게 관련된 면역 세포와 세포매개성면역과 체액성면역을 측정하기 위하여 세포성 면역반응 및 유세포 분석 그리고 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 측정하였다. SPA의 경우 백신접종군은 대조군에 비하여 통계학적으로 유의있게 증가 하여 세포매개성 면역반응에 관하여 효과적임이 확인되었다. 비장세포에서의 세포매개성 면역에 관련된 T lymphocyte의 CD3+ CD4+와 CD3+ CD8+비율과 Blymphocyte CD45R의 비율을 측정하기 위하여 유세포분석을 시행하여 본 결과, CP39, ToxA,FimA, ToxA, F1P2,으로 자극시킨 T cell subset의 CD3+CD4+와 CD3+CD8+의 백분위는 백신접종군이 대조군의 비해 통계학적으로 유의있게 증가되었으며 B cell subunit CD45R에서도 같은 결과를 얻었다. 또한 백신접종 후 각 세포 매개성 면역반응과 체액성 면역반응에 관련있는 싸이토카인을 splenocyte에 각 해당 항원을 자극시킨 후 Real time PCR로 측정하여 본 결과,백신접종군은 대조군에 비하여 모두 높게 나왔으나 INF-r만이 통계학적의 유의가 있는 값을 나타내었다. IL-4의 분비는 대조군의 비하여 높게나왔으나 통계학적으로 유의있는 값을 나타내진 못하였다. 이는 약독화된 살모넬라의 전달계시스템을 이용함으로써 INF-r의 분비가 자극됨으로써 길항작용으로 IL-4의 분비는 보다 낮게 측정됨을 관찰할 수 있었다. 비강으로 백신접종을 실시할 때 폐조직에서의 염증반응이 일어났다가 회복이 되는 시기를 판단하기 위하여 백신군과 대조군의 폐를 백신 후 3일차와 4주차에 분리하여 조직학 사진으로 관찰한 결과 4주가 되는 시기에 폐조직이 회복되어 최적화실험에서의 2차 접종 및 3차 접종시기를 3주로 결정하였다.
8. 실험동물을 이용한 위축성 비염 및 파스튜렐라 폐렴 예방 생균 백신의 최적화 실험
백신접종 후 각 1회 2회 3회 접종군에서의 세포 매개성 면역반응과 체액성 면역반응에 관여하는 싸이토카인을 splenocyte에 각 해당 항원을 자극시킨 후 Real time PCR로 측정하였다. 앞서 혼합접종시에 측정된 싸이토카인을 선택하고 각 구룹 별 선택된 항원; ptfA, F1-P2으로 자극시킨 뒤 분비되는 사이토카인을 측정하였을 시 Th1을 자극 하는 INF-r를 의 경우1차,2차, 3차 접종군에서 대조군의 비해 통계학적의 유의가 있는 수치가 관찰되었으며 Th2을 자극하고 점막면역에 관여하는 sIgA를 유도시키는 IL-4의 경우 1차접종의 경우 유의 있는 값은 아니지만 증가가 되었으며 2차 3차접종군에서는 INF-r의 길항작용으로 상대적으로는 낮지만 대조군의 비하여 통계학적으로 유의 있는 값이 측정되었다. 이는 1차 접종을 시행 할 때 보다 booster를 통하여 점막면역 및 기억세포를 통한 방어 효과가 뛰어남이 확인되었다. 공격시험후 대조군의 상태가 악화되어 폐사직전의 시기를 선택하여 백신 접종 군과 대조군의 폐 조직을 분리하여 관찰하였다. 사진에서 보는 것과 같이 3차접종군의 경우 접종을 여러 번 실시하여 조직의 염증감염에 관여된 대식세포의 분비가 많이 분비되어 조직전체에 염증이 생기고 대조군과 차이가 거의 없음이 관찰되었다. 1차 접종군의 경우역시 대식세포의 분비가 전체적으로 많이 진행된 상태를 관찰할 수 있었다. 그러나 2차 접종의 경우 다른 구룹 군과 다르게 폐 조직이 회복되는 단계이며 이는 한번 booster할시 기억세포에서 항원을 보다 빠르게 분비시키고 접종횟수를 낮춤으로써 폐조직의 손상이 3차 접종에 비하여 낮다고 판단되었다.
결론적으로 백신균주의 개별항원 접종 시와 백신균주의 개별항원을 혼합하여 접종했을시 혼합하여 접종하였을 때 개별 항원에 대한 면역반응 이 효과적으로 유도됨이 관찰됨으로써 백신 균주의 개별항원을 혼합으로 접종을 시행하고 싸이토카인의 역가가 높게 측정되는 booster를 시행해야함이 판단되었고 공격시험 후 조직학사진을 통하여 폐 조직손상도가 낮고 빠르게 회복이 되는 2차 백신접종이 안정하고 효과적이라는 결론이 나왔다.
9. 국내 주요 호흡기 질병 원인균 분리 및 동정, 양돈장에서 분리된 병독성 호흡기 질병 원인균 병독성 시험
1) 목적동물인 돼지에서의 호흡기 원인균 분리 및 동정
총 23주가 분리되었으며 그 중 APP 12주, S. suis 5주 및 PM 6주가 각각 분리 동정되었다.
2) 항생제 감수성 검사
분리된 APP 12주에 대한 항균제 감수성 시험결과는 표 8에서와 같았다. 돼지 유래균주의 항균제 내성률은 oxytetracycline (91.7%), sulfametho/trimethoprim (75.0%), florfenicol과 kanamycin (66.7%) 및 Penicillin (50.0%) 순이었으며 amoxicillin/clavulanic acid (83.3%)에 대해서는 비교적 높은 감수성을 보였다.
3) 마우스를 대상으로 한 병원성 실험.
분리된 세균들에서 마우스 병원성을 확인하기 위해 각각 균주의 배양액을 농축하여 PBS로 washing하고 생균수를 측정한 다음 PBS로 10진 희석하여 농도별로 마우스에 접종하여 생존 여부를 관찰하였다.
4) 돼지를 대상으로 한 병원성 실험.
3주령 자돈에 Pasteurella multocida를 접종 후 14일이 경과한 시점에 모든 돼지를 안락사 시킨 다음 비갑개를 절개하여 위축성 비염 발병 유무를 비교 (그림 21과 22)하여 본 결과는 표 14에서 보는 바와 같았다. 즉, 2 × 10⁷ CFU/㎖를 5㎖ 접종한 그룹은 1마리에서, 2 × 10⁷ CFU/㎖를 5㎖ 접종 그룹에서는 3마리에서 2 × 10⁷ CFU/㎖를 5㎖를 접종한 그룹에서는 5마리에서 각각 전형적인 비갑개 이상 자돈이 관찰되었다
10. 목적 동물에서의 위축성 비염 및 파스튜렐라 폐렴 예방 생균 백신 예비 실험
목적동물인 모돈에 예방백신을 근육 또는 경구 접종한 후 출생한 자돈에 도전감염시켜 최적의 접종경로를 결정하였다.
11. 모돈에서 점막면역 활성 delivery system을 이용한 위축성 비염 및 파스튜렐라 폐렴 예방생균 다가 백신의 효능 및 백신의 안전성 실험
임신 모돈에 백신을 과용량 또는 반복적으로 경구 접종하여 발열, 균 배출 및 유사산등과 같은 임상 증상이 관찰되지 않았을 뿐만 아니라 혈액학적 및 혈액 생화학적으로 부작용여부를 관찰하여 본 결과 부작용이 관찰되지 않았다. 이는 백신 접종에 있어 실수로 과용량 또는 반복 투여에 의한 부작용 없이 백신을 투여 할 수 있음을 보여 주는 결과라 할 수 있다. 또한 모돈에 백신을 경구 접종 한 후 유도되는 항체 역가를 측정하여 본 결과 모든 항원에 대해 접종 후 3주 째부터 증가하기 시작하여 모돈이 분만하는 시기인 백신 8주 째에 모든 항원에 대해 유의성 있는 결과가 관찰되었으며 더불어 초유에서도 모든 항원에 대해 IgA 및 IgG가 유의성 있는 증가가 관찰되어 모돈에 경구 접종하였을 경우에도 안정적으로 면역 반응을 유도함을 확인할 수 있었다. 또한 백신 접종 된 임신 모돈에서 출생한 자돈이 3주령이 되었을 때 전북대학교에 설치된 자돈사로 운송하여 일주일간의 적응 기간을 거친 후 Pasteurella multocida serotye A와 D로 도전 감염 시켜 비강에서의 정상 유무로 방어 여부를 확인하여 본결과, 백신 접종 군에서는 80%가 정상으로 그리고 대조군에서는 40%만이 정상의 비강 상태가 관찰되어 모돈에서 유도된 항체가 포유 자돈에 이행 되어 위축성 비염을 성공적으로 방어 하는 것을 확인할 수 있었다. 이의 결과는 위축성 비염을 예방하기 위해서 필요한 점막면역이 포유자돈에 이행되었음을 간적적으로 확인해 주느 결과라 할 수 있다.
이와 같은 결과를 종합하여 보면 모돈에 백신을 과용량 또는 반복적인 투여에 의해서도 백신 부작용은 관찰되지 않았으며, 모돈에 경구 접종 하여 자돈이 제대로 포유를 한다면 위축성 비염을 예방하는데 필요한 점막면역 항체를 이행 받아 위축성 비염을 예방 할 수 있을 것으로 생각되었다. 더불어 개발 백신은 경구 접종이 가능하기 때문에 양돈농가에서 접종 방법에 있어 보다 간편하고 손 쉽게 백신 접종을 할 수 있을 것으로 생각되었다.
12. 자돈에서 점막면역 활성 delivery system을 이용한 위축성 비염 및 파스튜렐라 폐렴 예방생균 다가 백신의 효능 및 안전성 실험
모돈 및 자돈에 각각 백신을 경구 또는 근육 접종 한 후 도전감염 균주에 대한 방어여부를 확인하며 자돈에서의 백신의 안전성 여부를 조사한다.
13. 흉막 폐렴 예방 생균 백신 개발을 위한 주요 병원성 인자 항원 발굴 및 항원 유전자 확보
백신 후보균주를 혼합하여 마우스에 접종 횟수를 달리하여 사료 섭취량, 체중 변화 및 분변에서의 균 배출 여부 그리고 폐 등에서의 임상 변화와 같은 부작용을 관찰하여 본 결과접종 횟수와 상관없이 부작용이 관찰되지 않아 안전하면서 효과적으로 면역 반응을 유도함이 확인되었다.
14. 흉막폐렴 주요 병원성 인자에 대한 각 단백 항원 확보
1) 원인균 : Actinobacillus pleuropneumoniae 2형과 5형
국내 돼지에서 흉막 폐렴은 현재 전 세계적으로 발생하는 질병으로 국내에서도 최근 전국적으로 발생하고 있으며, 기후의 급변, 수송 또는 밀집사육 등에 의한 스트레스와 밀접한 관계를 가진다. 발병은 모든 연령의 돼지에서 감수성이 있으나 후보돈과 비육 말기돈에서 폭발적으로 발병한다. 특히 흉막 폐렴은 급성형에 의한 폐사율의 증가와 만성형에서 사료효율 감소, 성장 지연 등에 의한 경제적 손실이 막대하다. 흉막폐렴을 유발하는 병원균의 부착인자와 독소가 면역원성과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 면역원성과 관련되 부착인자와 독소를 중심으로 그 유전자를 특이 primer 를 이용하여 증폭시켜 확보하였다.
2) 면역원성과 관련된 주요 부착인자와 독소들
OmpA, Apx IA, Apx IIA, ApX IIIA
15. 병원성 유전자가 제거된 점막면역 활성 delivery system을 이용한 흉막 폐렴 예방 생균 백신 개발
APP의 병원성 인자인 Apx IA, Apx IIA, Apx IIIA를 발현/분비 벡터인 pBP244에 클로닝한 후 이를 약독화 살모넬라에 형질전화하여 Wetern blot으로 발현 및 분비여부를 확인해 본 결과 모든 항원에 대해 발현 및 분비가 잘 이루어 지고 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 이들 항원을 분비하는 각 약독화 살모넬라 균주를 생균 백신 균주로 사용하였다.
16. 흉막 폐렴 예방 생균백신 생체 내에서의 병원성 획득 실험
BALB/c micedp 병원성 회복을 위해 접종 및 균 분리를 반복하여 마우스에 5 × 10⁷ CFU/20㎕ 비강 접종시에 LD₅₀이 확립되었으며 앞으로 이 균수로 도전감염 최종 균수로 확정하였다.
17. 마우스를 이용한 흉막 폐렴 예방 백신의 안전성 실험
각 항원을 발현하는 백신 후보균주를 혼합하여 마우스에 접종한 후 각 항원에 대한 Serum IgG 및 fecal IgA를 측정하여 본 결과 각 항원에 대해 모두 면역 반응이 유도됨을 확인할 수 있었다. 또한 splenocytes를 분리하여 각 항원으로 자극한 후 CD4, CD8, CD45R를 측정하여 본 결과 각 항원에 대해 증가되었음을 또한 확인할 수 있었다. 더불어 백신 접종 군의 splenocytes에서 각 항원에 대한 IL-4의 농도는 대조군에 비해 상대적으로 적게 증가하였지만 IL-6와 IL-12의 농도는 대조군에 비해 월등하게 증가하여 delivery strain에 의해 전달된 항원은 한 번의 비강 접종에 의해 Th1 type의 면역 반응을 강하게 유도함을 확인할 수 있었다. 물론 돼지에서 흉막 폐렴을 방어하기 위해서는 Th2 type의 면역 반응에 의한 면역 유도가 필요하기 때문에 비강 접종의 접종 횟수에 대한 또다른 실험이 필요하다는 것을 반증하는 실험 결과이기도 하다. 비강 접종 후 도전감염에 따른 폐사율을 조사하여 본 결과 백신 접종 군에서는 70%가 생존한 반면, 대조군에서는 60%가 폐사하였기 때문에 혼합 백신을 비강 접종함으로써 Th1 type과 관련된 mucosal IgA 및 serum IgG를 강하게 유도하며 흉막폐렴을 충분히 방어할 수 있음을 확인할 수 있었다.
18. 마우스를 이용한 흉막 폐렴 예방 백신의 효능 실험
접종 횟수에 따른 항체 유도여부를 확인하여 본 결과 접종 횟수에 상관없이 serum IgG의 경우 모두 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 관찰되었다. 하지만 2회 및 3회 접종한 그룹에서 1회 접종한 그룹보다 높은 혈청 IgG가 관찰되었다. 분변 IgA의 경우에는 2회 접종한 그룹에서 1회 및 3회 접종한 그룹보다 더 유의성 있는 항체 역가과 관찰되었다. 또한 splenocytes를 각 항원으로 자극한 후 실시간 PCR을 이용하여 접종 횟수에 따른 IFN-γ와 IL-4의 발현을 대조군과 비교해 본 결과 IFN-γ의 경우에는 1회 접종 때에 최고의 발현율을 보이다 접종 횟수가 증가함에 따라 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었지만 IL-4의 경우에는 접종 횟수가 증가함에 따라 그 발현율도 증가하였다. 하지만, Apx ⅠA 및 Apx ⅢA 두 항원의 경우에는 3회 접종시에 IL-4의 수치가 낮게 확인되었는데, 이는 3회 접종시에 항원 자극에 대해 반응이 빨리 시작되어 IL-4를 빨리 생산하고 사라진 것으로 추측되었다. 또한 도전감염에 대한 방어율을 보면 2회 접종한 그룹이 가장 탁월한 방어효과가 관찰되어 돼지에서 흉막 폐렴을 예방하기 위해서는 2회 접종이 가장 탁월한 예방 효과를 나타 낼 것으로 확인되었다.
19. 실험동물을 이용한 백신의 최적화 실험
각 해당 항원 발현 백신균주들의 혼합 후 비강내로 1회, 2회 및 3회 접종한 다음 유도된 면역반응과 도전감염에 대한 방어 여부를 통해 접종 횟수를 결정하였다.
20. 임신 모돈에서 흉막 폐렴 백신의 안전성 실험
분만 예정 8 ～ 9주 전인 모돈 중에서 살모넬라균 및 흉막폐렴에 감염된 병력이 없는 모돈과 흉막폐렴에 대한 예방접종이 실시되지 않았던 모돈에 경구 접종한 후 임신 기간 동안 유사산 및 발열, 백신 균주의 분변으로의 배출여부 그리고 이상 행동 여부에 대한 조사를 실시하여 본 결과, 백신 접종 후 모돈에서 유사산이 발생하지 않았으며, 살모넬라 백신 균주를 분변으로 배출하지도 않았다. 또한 백신 접종 후 발열과 같은 이상 증세가 나타나지 않았으며 출생한 자돈 모두 기형 없이 출생하였으며 백신을 접종하지 않은 군과 별 차이가 관찰되지 않아 백신으로 인한 부작용은 없는 것으로 생각되었다.
21. 목적동물에서 흉막폐렴 예방 생균 백신의 효능실험
이휴 자돈 중에서 살모넬라균 및 흉막폐렴에 감염된 병력이 없고 흉막폐렴에 대한 예방접종이 실시되지 않았던 4주령 자돈에 2회 경구 접종한 후 각 항원에 대한 Serum IgG를 측정하여 본 결과 1차 접종 2주 후부터 혈청 IgG의 역가가 증가함을 확인할 수 있었다. 도전감염 후 흉막폐렴 방어여부를 확인하여 본 결과, 대조군에 비해 방어 효과가 우수함이 관찰되었다.
22. 돼지에서 백신의 효능을 향상시킬 점막 면역에 효과적인 adjuvant 개선 및 백신의 최적화
개발백신의 효능을 증가 시키기 위해 백신을 adjuvant 인 Montanide IMS 1313 VG(Seppic 사 제품)와 혼합하여 경구 접종하여, 백신의 효능을 비교하여 보았다. 그 결과, 생균백신만을 접종할 때보다 Montanide IMS 1313 VG를 adjuvant로 사용하였을 때 보다 높은 항체 역가가 관찰되었다.
23. 현장에서 위축성 비염, 파스튜렐라 폐렴, 흉막폐렴, 예방 생균 백신과 다른 상업용 백신과의 단순 효능 비교 실험
현장에서 현재 상용화 되어 판매되고 있는 상업용 백신을 구입하여 생균 다가 백신과 단순히 방어효과만을 비교분석하여 본 결과, 시판되는 상업용 백신보다 도전감염균주에 대한 방어 효과가 우수하였다.
24. 각 호흡기 질병이 유행하는 양돈장에서의 생균백신의 적용 실험
세균성 호흡기 질병이 만연하는 농장에서 개발된 생균 백신을 접종한 후 접종하지 않은 그룹과 비교하여 본 결과 백신을 접종한 그룹에서 접종하지 않은 그룹보다 호흡기 질병이 적게 발생하는 것이 관찰되었다.
25. 백신의 안정성 확인 시험
백신을 멸균 생리식염수로 10진 희석한 후 DAP가 함유된 LB배지에 10진균수시험 결과, 8개의 시험백신 모두 9개월경과 시점까지 백신 1두 분 중 균수가 109CFU 이상으로 확인되었다. 희석액 1 ㎖를 접종하고 37℃에서 48시간 배양하여 평판법으로 균수를 측정하였다.
26. 백신의 제품화를 위한 전략수립
코미팜에서는 2016년부터 백신의 품목허가를 위한 본격적인 절차에 돌입할 예정이며,지금까지의 연구 결과를 바탕으로 백신의 임상시험 실시를 위한 임상시험 계획서를 농림축산검역본부에 제출하고자 한다.

Abstract ▼

II. Summary
An expression/secretion plasmid containing genes encoding the FimA, CP39, PtfA, ToxA and F1P2 antigens associated with porcine pneumonic pasteurellosis and progressive atrophic rhinitis (PAR) was constructed and harbored in an attenuated Salmonella Typhimurium, which was used as the v

II. Summary
An expression/secretion plasmid containing genes encoding the FimA, CP39, PtfA, ToxA and F1P2 antigens associated with porcine pneumonic pasteurellosis and progressive atrophic rhinitis (PAR) was constructed and harbored in an attenuated Salmonella Typhimurium, which was used as the vaccine candidate. The immune responses induced by this delivery strain were investigated in a murine model. Each antigen secreted from the delivery strain was confirmed by Western blot analysis. Thirty BALB/c mice were divided equally into two groups; group A were intranasally inoculated with the mixture of the five delivery strains, and group B were inoculated with sterile PBS. In group A, all antigen-specific serum IgG were significantly increased compared to those of group B from the 2nd week post-inoculation (WPI) till the 8th WPI. All antigen-specific mucosal IgA in group A were also significantly greater than those of group B. In addition, the significant splenic lymphocyte proliferative responses, the elevations of CD3(+)CD4(+), CD3(+)CD8(+) and B-cell populations, and the induction of IFN-γ expression in group A were observed.In conclusion, the mixture of five delivery strains expressing specific antigen for these diseases was found to be capable of inducing significant humoral and cellular immune responses.
Mice were intranasally inoculated at various times to optimize the vaccination strategy with a new live candidate vaccine expressing the antigens CP39, FimA, PtfA, and ToxA of Pasteurella multocida and F1P2 of Bordetella bronchiseptica in an attenuated live Salmonella system to protect against progressive atrophic rhinitis (PAR). Sixty BALB/c mice were divided equally into 4 groups. The group A mice were vaccinated only at 12 wk of age, the group B mice received a primary vaccination at 9 wk of age and a booster at 12 wk of age, the group C mice received a primary vaccination at 6 wk of age and boosters at 9 and 12 wk of age, and the group D mice were inoculated intranasally with sterile phosphate-buffered saline as a control. The humoral and mucosal immune responses of groups A, B, and C increased significantly compared with those of the control group.Expression of the cytokines interleukin-4 and interferon-γ in splenocytes also increased significantly. In addition, the group B mice exhibited significantly fewer gross lesions in lung tissue compared with the other vaccinated groups after challenge with a virulent P. multocida strain. These results indicate that a strategy of double intranasal vaccination can optimize protection against PAR.
In this study, the Actinobacillus pleuropneumoniae antigens ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA and OmpA were expressed in an attenuated strain of Salmonella (ΔlonΔcpxRΔ asd) for prevention of porcine pleuropneumonia. In order to evaluate the immunization strategy of the construct, a total 60 BALB/c mice were equally divided into four groups (n= 15). Group A mice were intranasally immunized only at 6-weeks-of-age, while group B mice were intransally primed and boosted at 6- and 9-weeks-of-age, respectively, and group C mice were intransally primed at 6-weeks-of-age and subsequently boosted twice at 9- and 12-weeks-of-age. Group D mice were used as a control, which were inoculated with sterile PBS. Groups A, B, and C showed significantly higher serum IgG and fecal IgA immune responses than those of the control group. After virulent challenge with a wild type A. pleuropneumoniae, the immunized groups A, B and C showed 33.3 %, 13.3 % and 26.7 % mortality as the control group showed 60 % mortality. These results showed that the protection against porcine pleuropneumonia using the construct can be optimized by a double intranasal vaccination.
Salmonella Typhimurium strain expressing the Actinobacillus pleuropneumoniae antigens, ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA and OmpA, was previously constructed as a vaccine candidate for porcine pleuropneumonia. This strain was a live attenuated (ΔlonΔcpxRΔ asd) Salmonella as a delivery host and contained a vector containing asd. An immunological study of lymphocyte proliferation, T-lymphocyte subsets and cytokines in the splenocytes of a mouse model was carried out after stimulation with the candidate Salmonella Typhimurium by intranasal inoculation. The splenic lymphocyte proliferation and the levels of IL-4, IL-6 and IL-12 of the inoculated mice were significantly increased, and the T- and B-cell populations were also elevated. Collectively, the candidate may efficiently induce the Th1- and Th2-type immune responses.
An expression/secretion plasmid containing genes encoding the FimA, CP39, PtfA and ToxA antigens associated with porcine progressive atrophic rhinitis (PAR) was constructed and harbored in an attenuated Salmonella Typhimurium as the vaccine candidate. The immune responses induced by this delivery strain were investigated in pigs.A total of 6 pregnant sows were divided equally into 2 groups; group A were inoculated with sterile PBS as control, group B sows were orally inoculated with the mixture of the four delivery strains. In group B, all antigen-specific serum IgG were significantly increased compared to those of group A at the 8th week post-inoculation(WPI). Colostrum IgA and IgA against antigen-specific in group B were also significantly greater than those of group A. Among 10 piglets from group A sows, PAR signs were observed in 8 piglets after challenge with Pasteurella multocida type D in their offsprings, while PAR signs were showed in only 6 of 10 piglets from group B sows. In conclusion, the mixture of 4 delivery strains expressing specific antigen for these diseases was found to be capable of inducing effectively protective immune responses.
In order to determine optimal vaccine strategy in piglets, 6 pregnant sows and their offsprings were used for this study. A total of 6 pregnant sows were divided equally into 2 groups; group A were inoculated with sterile PBS as control, group B sows were orally inoculated with the mixture of the four delivery strains. The offsprings of group B sows were intramuscularly immunized with the mixture of the four delivery strains at the 2nd weeks of age. The humoral and mucosal immune responses of groups A, B, and C increased significantly compared with those of the control group. All the vaccinated groups of sows and piglets exhibited significantly increased antibody levels relative to specific antigens when compared with those in the unimmunized control. The experimental piglets with the vaccine candidate did not experience PAR following challenge with the virulent Pasteurella multocida type D strains. However, PAR signs were observed in 60.0% of the control group after challenge with the challenge strains. These findings indicate that immunization of sows and their offsprings with the candidate vaccine may be optimal vaccine strategy for effective protection their young pigs against PAR.
Actinobacillus pleuropneumoniae causes porcine pleuropneumonia (PP), a highly contagious endemic disease that results in significant global livestock loss. The prevalence of serotypes and antimicrobial resistance patterns in recently isolated A. pleuropneumoniae strains from pigs with PP in South Korea were examined. A total of 65 A. pleuropneumoniae isolates were collected throughout Korea and were genetically serotyped using standard and multiplex PCR methods. Antimicrobial susceptibilities for all isolates were tested using the standardized disk-agar method. PCR was used to detect β-lactam, gentamicin and tetracycline-resistance genes. The random amplified polymorphic DNA(RAPD) patterns of the isolates were also determined by PCR. Of the 15 possible serotypes, South Korean pigs predominantly carried A. pleuropneumoniae serotypes 1 and 5. Among a total of 65 isolates, one isolate was sensitive to all 12 antimicrobials tested in this study. A total of 62 isolates was resistant to tetracycline and 53 of these isolates carried one or five tetracycline genes including the tet(B), tet(A), tet(H), tet(M), tet(C), tet(G) and/or tet(L)-1 markers. Among the 64 strains susceptible to a subset of all the tested antimicrobials, 26.6% were resistant to three or more antimicrobials, and Thirteen different antimicrobial resistance patterns were observed in the isolates and RAPD analysis revealed a separation of the isolates into two clusters: cluster II (6 strains resistant to 10 antimicrobials) and cluster I (theother59strains). These results show that serotype prevalence is somewhat different in South Korea relative to other parts of the world and multi-drug resistant strains are prevalent. RAPD analysis demonstrated that the six isolates resistant to 10 antimicrobials belonged to the same cluster.
Recombinant ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA, ApfA and OmlA protein of Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) antigens were expressed from an attenuated Salmonella (ΔlonΔ cpxRΔasd) mutant. Twenty Large Yorkshire piglets were divided equally into 2 groups(n=10). Group A piglets were orally inoculated with sterile phosphate buffered saline as a control at 4 weeks of age [0 week post inoculation (WPI)] and group B piglets were orally immunized with the mixture of the five delivery strains. The individual antigen-specific IgG concentrations in serum samples were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. All piglets were challenged with the mixture of wild type APP serotypes 1, 2 and 5 at 4 WPI. All antigen-specific serum IgG concentrations were significantly higher in group B piglets than in control group from 2 WPI until 4 WPPI. A total of 80% of group B piglets were protected against the challenge strain, while only 40% of group A piglets were protected. Overall, oral inoculation with our novel vaccine candidate can be considered an efficient protective immunization procedure against APP infection.
In this study, the efficacy of the combination of formalin-inactivated Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) and the individual B-subunit proteins of ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA of APP were evaluated in piglets. Twenty Large Yorkshire piglets were divided equally into 2 groups (n=10). All piglets were intramuscularly primed at 4 weeks of age [0 week post prime inoculation (WPPI)] and were orally boosted at 6 weeks of age(2WPPI). Group A piglets were inoculated with sterile phosphate buffered saline as a control and group B piglets were inoculated with the combination vaccine. The serotypes 2- and 5-specific IgG concentrations were determined in serum samples by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). All piglets were challenged with the mixture of wild type APP serotypes 2 and 5 at 4 WPPI. Each serotype-specific serum IgG concentrations were significantly higher in group B piglets than in control group from 2 WPPI until the end of this study. No clinical signs were observed from group B piglets after the challenge, while only 60% of group B piglets were protected against APP infections. Overall, intramuscular inoculation with our novel vaccine candidate can be considered an efficient protective immunization procedure against APP infection.
The efficacy of the combination vaccine of formalin-inactivated Actinobacillus pleuropneumoniae (APP), and the individual T- and/or C-terminal fragments of ApxIA, ApxIIA and ApxIIIA were evaluated in piglets. Fifty piglets were divided equally into 5 groups (n=10). All piglets were intramuscularly primed at 4 week-of-age [0 week post prime inoculation (WPPI)] and were intramuscularly boosted at 6 week-of-age (2 WPPI). Group A piglets were inoculated with sterile PBS and group B piglets were inoculated with formalin-inactivated APP only. Groups C, D and E piglets were inoculated with formalin-inactivated APP bacterins with the individual N-terminal fragments, the individual C-terminal fragments, and the individual N- and C-terminal fragments of ApxIA, ApxIIA and ApxIIIA, respectively. All proteins-specific IgG concentrations or titers by ELISA were significantly higher in groups C-E than group A from 2 WPPI until the end of this study. Clinical signs were observed from only 10% of groups C-E piglets after the challenge with the mixture of APP serotypes 1, 2 and 5 at 8 week-of-age (4 WPPI), while only 50% of groups A and B piglets were protected against APP infections. Overall, intramuscular inoculation with the combination of the bacterins and the recombinant fragments irrespective of the recombinant N- and/or C-terminal fragments of ApxIA, ApxIIA and ApxIIIA can efficiently protect piglets against APP infections.