초록 ▼

최근 항진균제 사용의 증가와 더불어 임상검체에서 분리된 자연내성과 획득내성 아스페르길루스균주에 대한 관심이 증가되고 있으나, 아스페르길루스 균주는 정확한 동정이 쉽지 않은 실정이다. 본 연구에서는 국내 다기관에서 분리된 아스페루길루스 균주를 대상으로 1) 항진균제 내성 아스페르길루스 균을 구별할 수 있는 체계적인 동정법을 확립하고 (2) 내성획득 기전과 전파기전 등을 조사하여 항진균제 내성 확산방지를 위한 기초 자료를 마련하고자 하였다. 먼저, 국내 11개 병원에서 분리된 아스페르길루스 총 351주를 대상으로 다양한 유전자부위에 대

최근 항진균제 사용의 증가와 더불어 임상검체에서 분리된 자연내성과 획득내성 아스페르길루스균주에 대한 관심이 증가되고 있으나, 아스페르길루스 균주는 정확한 동정이 쉽지 않은 실정이다. 본 연구에서는 국내 다기관에서 분리된 아스페루길루스 균주를 대상으로 1) 항진균제 내성 아스페르길루스 균을 구별할 수 있는 체계적인 동정법을 확립하고 (2) 내성획득 기전과 전파기전 등을 조사하여 항진균제 내성 확산방지를 위한 기초 자료를 마련하고자 하였다. 먼저, 국내 11개 병원에서 분리된 아스페르길루스 총 351주를 대상으로 다양한 유전자부위에 대한 염기서열분석과 질량분석기(matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)를 이용하여 동정을 시도하였다. 또 국내 분리 voriconazole 내성 Aseprgillus flavus 균주와 amphotericin B에 자연내성을 갖는다고 알려진 Aseprgillus terreus 균주를 대상으로 내성 기전을 연구하고 유전자형별 분석을 조사하였다. 전체 351주를 β-tubulin 염기서열분석법으로 동정한 결과, A. flavus complex를 제외하고는 대부분 균종 수준까지 잘 동정되었다. A. flavus complex 중 A. flavus는 calmodulin 염기서열분석에 의해 대부분 잘 동정되었으나 일부 추가 분석을 요하였다. β-tubulin이나 calmodulin 분석에 의해서만 동정된 숨은 균종(Cryptic species)로는A. awamori (34주), A. tubingenesis (22주), A. sydowii (16주), A. oryzae (5주), A. tamarii (2주), A. lentulus (2주) 및 A. calidoustus (1주) 등이 있었다. 질량분석기 MALDI Biotyper (cutoff value 1.7 기준)는 전체 균주 98.6%를 균종복합체 수준까지 정확하게 동정하였으나 균종수준까지 동정한 경우는 78.3%이었다. Voriconazole 내성 (MIC ≥ 2μg/ml) A. flavus 12주의 내성기전을 조사하였을 때 CYP51C 유전자변이가 내성균주뿐 아니라 감수성 균주에서도 관찰되어 내성 균주에 특이적인 표적 유전자변이 변이를 검출할수 없었다. 유전자 과발현을 조사하였을 때 이들 균주에서 MDR2, MDR4 및 Aflatrf 유전자과발현은 관찰되지 않았으나 대부분 MDR1과 Afmfs1 과발현이 관찰되었고 일부 표적유전자인 CYP51A 유전자도 증가되어 있었다. Microsatellite typing 결과, voriconazole 내성A. flavus 내성 12주 중 6주는 동일 유전자형이었는데, 이들은 동일 CYP51C 유전자변이 (S240A/D254G/N423D)를 보였다. Amphotericin B 고도 내성(MIC ≥ 8 μg/ml) A. terreus 균주의 경우 microsatellite typing에 의해 다양한 유전자형을 보였다. 본 연구는 국내 항진균제 내성 아스페르길루스 균종을 동정하기 위한 알고리즘을 제시하였고 국내에 voriconazole 내성 A. flavus 클론성 균주가 존재함을 보여 주었다.

Abstract ▼

Because of widespread use of antifungal agents over the past decade, concern has increased about acquired or innate antifungal resistance of clinical Aspergillus isolates from clinical specimens, but their correct identification is challenging. We performed accurate species identification of clinica

Because of widespread use of antifungal agents over the past decade, concern has increased about acquired or innate antifungal resistance of clinical Aspergillus isolates from clinical specimens, but their correct identification is challenging. We performed accurate species identification of clinical Aspergillus isolates from Korean hospitals and assessed their possible antifungal resistance mechanisms and genetic relatedness. A total of 351 clinical isolates of Aspergillus species obtained from 11 university hospitals between 2012 and 2013 were tested. Species identification of clinical Aspergillus isolates was performed by sequencing β-tubulin, calmodulin genomic regions and matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). For A. flavus isolates showing voriconazole resistance (VR, MIC ≥ 2 μg/ml), CYP51A, CYP51B and CYP51C genes were sequenced, and the expression of five genes was quantified using real-time PCR and genotyping was performed using microsatellite typing. The results showed that use of β -tubulin sequencing made it possible to identify most of the Aspergullus isolates from Korean hospitals to species level except for A. flavus complex isolates. A. flavus could be identified from A. oryzae by calmodulin sequencing, but some isolates need an additional testing. Cryptic species identifiable only by β-tubulin or calmodulin sequencing were as follows; A. awamori (34 isolates), A. tubingenesis (22 isolates), A. sydowii (16 isolates), A. oryzae (5 isolates), A. tamarii (2 isolates), A. lentulus (2 isolates), and A. calidoustus (1isolate). The rates of correct identification of MALDI Biotyper for cutoff value 1.7 were 98.6% at the complex level but 78.3% at the species level. All VR 12 A. flavus isolates exhibited one or more synonymous nucleotide polymorphisms in cyp51C, but all of themwere also found in voriconazole-susceptible isolates. The MDR1, Afmfs1 or CYP51A expression levels in most VR isolates were >2-fold higher than those in control isolates; there were no differences in other genes (MDR2, MDR4, Aflatrf) expression. Of 12 VR isolates of A. flavus, six ear isolates shared the same microsatellite genotype and they showed the same non-synonymous nucleotide polymorphisms (S240A/D254G/N423D) in cyp51C. A. terreus isolates with high level-amphotericin B resistance showed diverse microsatellite genotypes. Our findings illustrate the presence of the clonal strains of VR A. flavus among clincial isolates. In addition, here we provide the proposed algorithm for identification of Aspergillus species with innate or acquired antifungal resistance.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 정책연구용역사업 최종결과보고서 ... 2
• 목차 ... 3
• 보고서 요약문 ... 4
• Summary ... 5
• 정책연구용역사업 연구결과 ... 6
• 제1장 최종 목표 ... 6
• 제2장 국내외 기술 현황 ... 8
• 제3장 최종 연구내용 및 방법 ... 9
• 제4장 최종 연구결과 ... 17
• 제5장 연구결과 고찰 및 결론 ... 34
• 제6장 연구성과 및 활용계획 ... 38
• 제7장 정책연구용역사업 진행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 41
• 제8장 기타 중요변경사항 ... 42
• 제9장 연구비 사용 내역 및 연구원 분담표 ... 43
• 제10장 참고문헌 ... 45
• 제11장 첨부서류 ... 47
• 끝페이지 ... 48