[보고서]핵산조절기술을 이용한 항바이러스 핵산치료제 개발

정경은

보고서 정보

주관연구기관

에스티팜
ST Pharm Co., Ltd.

연구책임자

정경은

참여연구자

오종원

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2015-04

과제시작연도

2014

주관부처

산업통상자원부
Ministry of Trade, Industry and Energy

연구관리전문기관

한국산업기술평가관리원
Korea Evaluation Institute of Industrial Technology

등록번호

TRKO201600017997

과제고유번호

1415134678

사업명

바이오의료기기산업핵심기술개발사업

DB 구축일자

2017-09-20

키워드

C형간염바이러스 치료제.리피도이드 전달체.siRNA 항바이러스제.siRNA.

표 개발 대상 기술제품의 개요: 주요 기술개발 및 최종 사업결과물
표 Aptamer-siRNA chimeric RNA 타겟 및 전달단계.
표 복합체외 siRNA 탑재 모식도.
표 Aptamer-siRNA 복합체의 타겟 및 작용 모식도.
표 siRNA/HA 유도체 complex의 세포 및 동물 실험 평가 모식도
표 HCV 복제가 가능한 영장류 및 설치류 동물에서의 PRK2 유전자 구조.
표 (A) PRK2 유전자 개요 및 siRNA 타겟 부위. (B) siRNA를 간암세포주인 Huh7에서 HCV가 복제되고 있는 R-1 세포주(HCV 구조단백질이 결손된 HCV subgenome를 지닌 stable 세포주)에 lipofectamin RNA iMAX를 사용하여 전달한뒤 48시간 뒤 PRK2의 발현정도 (B) 및 HCV 유전자 카피수를 Western blot 및 real-time PCR로 각각 분석 함(C).
표 PRK2 siRNA의 특이적 항-HCV 효능.
표 세포주기를 FACS로 분석하고 HCV IRES에 의해 luciferase reporter가 발현되는 assay reporter를 사용하여 각각 분석한 결과 PRK2 특이적 siRNA(PRK2-1)가 세포주기 (A) 및 HCV IRES-의존적 단백질 합성 (B)에 영향을 미치지 않음을 볼 수 있었음
표 HCV 복제효소와 PRK2의 특이적 binding 분석.
표 HCV 감염세포주 에서의 PRK2 siRNA의 항바이러스 효능 분석.
표 HCV subgenomic replicon이 복제되고 있는 Huh7 간암세포주에 PRK2-1 siRNA를 lipofectamin RNA iMax 혹은 리피도이드 ND98을 사용하여 10 nM 최종농도로 전달한 결과 48시간 뒤 50%정도의 HCV 복제억제 효과를 나타냄을 볼 수 있었음.
표 신규 타겟에 대한 siRNA의 항-HCV 효능을 10 nM 농도로 lipofectamine을 사용하여 전달 후 분석 함.
표 (좌측) 인간 간 세포주(Huh-7)에서 신규 리피도이드의 세포 독성 평가. (siRNA를 전달하지 않은 세포주의 미토콘드리아 활성도 대비 % 비율로 표현). (우측) 기존 리피도이드(ND98, NA110, NA114)와 신규 리피도이드 (C12-SPM, C12-SPD, C12-PUT, C12-CAD)를 이용한 siRNA 전달(100 nM siRNA, 리피도이드:siRNA = 5:1) 후 측정된 세포 활성도 (siRNA transfection 후 2일째 측정).
표 (좌측) 기존 리피도이드와 신규 리피도이드를 이용한 siRNA 전달(25 nM siRNA, 리피도이드:siRNA = 5:1) 후 측정된 GAPDH 활성 감소. (우측) 50 nM siRNA 전달 후(리피도이드;siRNA = 5:1) 측정된 GAPDH 활성 감소. siRNA transfection 후 2일째 측정.
표 선별된 리피도이드(ND98, NA114, C12-SPM)를 이용하여 인간 간세포주(Huh-7) 내로 PRK2 siRNA 전달한 후 측정된 PRK2 발현양 비교
표 생체 내로의 siRNA 전달을 위한 리피도이드 기반 리포좀 제형.
표 생체 전달용 리피도이드(ND98) 제형을 이용한 리포터(luciferase) 단백질 전달.
표 리피도이드(ND98)를 이용하여 소동물 모델 (쥐)의 간 조직으로 PRK2 siRNA를 전달한 후 측정된 PRK2 발현양 비교
표 (A) PRK2 유전자 개요 및 siRNA 타겟 부위. (B) siRNA를 간암세포주인 Huh7에서 HCV 가 복제되고 있는 R-1 세포주(HCV 구조단백질이 결손된 HCV subgenome을 지닌 stable 세포주)에 lipofectamin RNA iMAX를 사용하여 PRK2 타겟 siRNA를 각각 10 nM 최종 농도로 전달한 뒤 48 시간 뒤 PRK2의 발현정도 및 HCV NS5B 발현양 을 Western blot으로 분석한 결과임.
표 HCV 복제 세포주 에서의 PRK2 siRNA의 항바이러스 효능 분석.
표 Huh7 간암 세포주에 PRK2-1 siRNA를 lipofectamin RNA iMax(좌측) 혹은 그림에 표시한 1차 선별된 전달능이 우수한 리피도이드(ND98, C12-SPM)를 사용하여 PRK2 siRNA의 리포터 발현 억제효과를 분석함. 비특이적 siRNA인 scrambled siRNA를 전달한 대조군 및 mock 대조군과 비교 시 리포터 발현을 50-80% 억제함을 볼 수 있었음(우측).
표 HCV IRES 타겟팅 siRNA.
표 HCV IRES 타겟팅 siRNA의 항바이러스 효능 분석
표 HCV IRES 타겟팅 siRNA siIE22의 IC50 결정
표 분리된 쥐 간세포에 electroporation으로 GFP 발현벡터를 도입하고 collagen coating된 plate에서 배양 후 형광현미경으로 이미지를 분석한 결과.
표 분리된 마우스 primary hepatocyte를 2주 이상 세포배양하며 간세포기능이 유지되고 있는지 확인하기 위해 albumin 생산여부와(좌측) 간세포 특이적 전사인자인 HNF3beta 발현을(우측) RT-PCR로 분석한 결과 인간간암세포주인 Huh7과 이로부터 유래한 HCV subgenmic replicon를 함유하고 있는 stable cell line R1 보다 마우스 primay hepatocyte에서 이들의 발현이 현저히 높음을 볼 수 있었음. 분리된 간세포가 정상적 기능을 유지하고 있음을 보여주는 결과 임.
표 리피도이드 ND98로 mouse primary hepatocyte에 도입된 PRK2 siRNA의 타겟 유전자 발현 억제 효능 평가.
표 리피도이드의 마우스 hepatocyte로의 siPRK2-1 전달효능 분석 결과.
표 마우스 간에 전달된 siIE22에 의한 리포터 유전자 발현 억제 효과 분석 결과
표 마우스 xenograft 모델에서 PRK2 활성억제제 HA1077의 항-HCV 효능 분석 결과.
표 마우스 xenograft 모델에서 siPRK2-1의 항-HCV효능 분석
표 인간 PBMC와 HEK293 인터페론 베타 프로모터 활성 에세이용 벡터를 도입 후 처리한 siRNA나 double strand RNA인 polyI:C에 의한 선천성 면역반응 유도분석 결과.
표 선별된 siRNA의 인터페론 알파 발현 유도 분석
표 리피도이드 유도체(C12-SPM)와 siRNA의 복합체 형성 확인(전기영동분석).
표 C12-SPM 유도체를 이용한 형광물질 (Cy3)로 표지된 siRNA 전달 이미징 분석.
표 (좌측) C12-SPM을 이용한 PRK2 siRNA 전달 후 인간 간세포주 (Huh-7) 내 PRK2 발현 측정을 위한 정량적 PCR 분석 (siRNA 전달 후 2일째에 측정). (우측) C12-SPM을 이용하여 PRK2 siRNA를 HCV subgenome 보유 인간 간세포주(R1) 내로 전달한 후 관찰된 HCV 복제 감소(siRNA 전달 후 2일째에 측정).
표 C12-SPM에 탑재된 PRK2 siRNA 마우스 정맥 투여 후 2일 째 측정된 PRK2 발현 정량적 분석.
표 리피도이드 유도체(ND98)와 siRNA의 복합체 형성 확인(전기영동분석).
표 ND98 유도체를 이용한 형광물질(FAM)로 표지된 siRNA 전달 이미징 분석.
표 (좌측) ND98을 이용한 PRK2 siRNA 전달 후 인간 간세포주(Huh-7) 내 PRK2 발현 측정을 위한 정량적 PCR 분석(siRNA 전달 후 2일째에 측정). (우측) ND98을 이용하여 PRK2 siRNA를 HCV subgenome 보유 인간 간세포주(R1) 내로 전달한 후 관찰된 HCV 복제 감소(siRNA 전달 후 2일째에 측정).
표 ND98에 탑재된 PRK2 siRNA 마우스 정맥 투여 후 2일 째 측정된 PRK2 발현 정량적 분석.
표 간세포로의 특이적, 효율적 siRNA 전달을 위한 C12-SPM 유도체 개량
표 Galactose가 표적리간드로 도입된 C12-SPM 리피도이드 유도체를 이용하여 인간 간세포주 내로 PRK2 siRNA 전달 후 2일째에 수행된 PRK2 발현 정량적 PCR 분석.
표 siRNA의 안정성(stability) 향상과 면역반응유도를 억제하기 위한 수식구조.
표 (A) 50% 혈청에서 siPRK2-1의 안정성 분석. (B) 수식화 된 siRNA선별을 위한 50% 혈청에서의 안정성 분석.
표 siPRK2-1와 수식화 된 siPRK2-1의 HCV 복제 억제 효능 비교 평가
표 (A) 50% 혈청에서 siIE22의 안정성 분석. (B) 수식화 된 siRNA선별을 위한 50% 혈청에서의 안정성 분석.
표 siIE22와 수식화 된 siIE22의 HCV 복제 억제 효능 비교 평가.
표 Xenograft model 에서의 HCV 복제 억제 효능 평가
표 Xenograft model에서 바이러스가 안정적으로 혈청 내에 유지됨을 확인 함(그림 D 좌측), PRK2 활성억제제인 HA1077(fasudil)을 투여하여 항바이러스 효능을 분석(그림 D 우측)
표 Xenograft model에서의 siPRK2-1의 항바이러스 효능을 분석
표 (A) Xenograft model에서 수식화된 siPRK2-1의 항바이러스 효능 평가. (B) Xenograft model에서 ND98/liposome으로 싸여진 siRNA가 대부분 간에 가있음을 확인.
표 (좌측) HCV IRES 구조 및 염기서열. 표시된 부분은 siIE22의 타게팅 부분.(우측) HCV IRES 타겟팅 siRNA siIE22의 IC50 결정
표 (A 와 B) 마우스 in vivo 모델에서 HCV IRES 타겟팅 siRNA의 항바이러스 효과를 보기위한 타임 테이블과 HCV IRES 타겟팅 siRNA의 항바이러스 효과를 마우스 in vivo 모델에서 분석하기 위한 dual luciferase reporter 구조. (C) 마우스 간에 전달된 siIE22에 의한 리포터 유전자 발현 억제 효과 분석 결과.
표 (A) Xenograft model에서 수식화된 siIE22의 항바이러스 효능 평가. (B) Xenograft model에서 ND98/liposome으로 싸여진 siRNA가 대부분 간에 가있음을 확인.
표 간세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 당 리간드로 수식된 리피도이드 제형
표 당으로 수식된 리피도이드 제형 (C12-SPM-PG, C12-SPM-PL)과 일반 제형 (C12-SPM)의 간세포 내로의 PRK2 siRNA 전달 효율 분석.
표 형광물질로 표지된 siRNA를 포함한 리피도이드(C12-SPM) 제형의 정맥 투여 후 조직별 형광 분포 LIVE 이미징 분석(투여 후 2시간에 측정).
표 당으로 수식된 리피도이드 리포좀 제형의 TEM 및 파티클 크기 측정을 위한 DLS 분석.
표 리피도이드(C12-SPM) 제형을 이용한 PRK2 siRNA 생체 내 전달(마우스 모델). 정맥 투여 후 2일째 수거된 간세포 내 PRK2 발현을 조사하기 위한 정량적 PCR 분석.
표 siRNA의 안정성(stability)향상과 간으로의 전달을 위한 서열 수식.
표 합성한 siRNA 목록
표 수식된 siRNA의 혈청 내에서의 안정성을 평가 함.
표 (좌측) 위의 23가지의 서열을 reporter를 지닌 HCV subgenome이 안정적으로 복제되고 있는 세포주에서 항 -HCV 효능을 100 pM에서 분석. (우측) 그림 2 왼쪽 그래프에서 선별된 서열을 HCV subgenome이 복제되고 있는 R-1 세포주에서 항-HCV 효능을 10 nM에서 분석.
표 Passenger strand에 수식되어 있는 선별된 서열에 PS수식을 guide strand에 도입
표 그림 5의 서열을 HCV subgenome이 복제되고 있는 R-1 세포주에서 항바이러스 효능을 1 nM에서 분석.
표 그림 6에서 항바이러스 효능이 좋은 것을 선별해 혈청에서 안정성을 평가함.
표 HCV IRES를 지닌 reporter를 마우스 간에 전달한 후 siIE22(No.26) iposome 제형을 1 mg/kg 용량으로 정맥주사 하고 16시간 뒤 전달된 siRNA의 리포터 유전자 발현 억제 효과를 uciferase assay로 분석 함.
표 좌측) 전달체 없이 naked 서열을 5 mg/kg 용량으로 정맥주사 후 20분 뒤 전달된 siRNA의 guide strand의 카피수는 Taqman probe를 사용한 real-time qRT-PCR로 분석함. (우측) 전달체 없이 naked 서열을 5 mg/kg 용량으로 정맥주사 후 20분 뒤 전달된 siRNA의 guide strand의 카피수를 비장에서 Taqman probe를 사용한 real-time qRT-PCR로 분석함.
표 PS 수식된 siIE22를 ND98/liposome으로 제형한 후 HCV 복제 마우스모델(xenograft모델)에 꼬리 정맥을 통해 3일 간격으로 1 mg/kg 농도로 주입.
표 PS 수식된 siPRK2를 ND98/liposome으로 제형한 후 HCV 복제 마우스모델(xenograft모델)에 꼬리 정맥을 통해 3일 간격으로 3 mg/kg 농도로 주입.
표 간세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 당쇄 리간드로 수식된 리 피도이드(C12-SPM) 제형의 모식도 및 크기/형태를 분석하기 위한 DLS, TEM 분석.
표 Galactose 당쇄로 수식된 리피도이드(C12-SPM-PG) 제형을 이용한 PRK2 siRNA 전달 후 간 조직 내 siRNA의 존재를 검증하기 위한 northern blot 분석(당쇄로 수식되지 않은 C12-SPM 제형과 비교).
표 HCV xenograft 마우스 모델에 C12-SPM 기반 리피도이드-PRK2 siRNA 제형을 주입하는 프로토콜.
표 리피도이드(C12-SPM) 제형을 이용한 PRK2 siRNA 생체 내 전달(HCV xenograft 마우스 모델) 후 혈액 내 HCV titer를 정량하기 위한 PCR 분석.
표 간암세포 이식 미우스의 해부학적 분석.
표 간암세포 이식 마우스에서 human albumin이 검출되는 지를 ELISA로 분석 한 결과.
표 감암세포가 이식된 마우스에 HCV(2x109 copies/ml)를 200 μl(4x108 copies) tail vein injection하여 감염시키고 2주간 혈청내 HCV RNA titer를 분석한 결과
표 감암세포가 주입 후 splenectomy로 spleen를 절제하는 수술 과정.
표 간조직에 직접 이식된 인간간세포를 지닌 마우스 모델에서 HCV의 복제정도를 분석한 결과 10^5 - 10^6copies/ml 의 HCV 게놈이 혈청에서 검출됨을 확인 할 수 있었음.
표 Expsome으로 도입 된 gs_PS1 siIE22의 항바이러스 효능 분석 결과.
표 Lipidoid stock solution의 제조
표 C형 간염바이러스 IRES 타겟팅하는 siIE22와 이전에 보고되어진 서열들.
표 HCV 게놈에 Renilla 루시퍼레이즈 리포터 유전자가 삽입되어 복제에 따라 루시퍼레이즈 활성이 증가하는 replicon을 사용하여 Somagenics사의 서열들의 항바이러스 효능을 비교 평가함.
표 C형간염바이러스 서브 게놈이 안정적으로 복제되고 있는 R-1 세포주에서 Xavier University의 서열들(Xi_316-334, Xi_si321) 및 Tokyo Metropolitan Institute 의 서열(TK_9.10)과 gs_PS1 siIE22와의 항바이러스 효능을 qRT-PCR 분석법으로 비교 평가함.
표 면역 침강법으로 얻어진 Ago2 복합체를 이용하여 Somagenics사의 HCVc-wt siRNA와 PS 수식화 된 siIE22와 수식화 되지 않은 siIE22의 타겟 RNA의 절단능력을 비교 평가하였음.
표 (A) 그림5와 같은 방식으로 면역침강으로 회수한 Ago2 복합체를 사용하여 타겟 절단능을 비교한 결과. (B) siIE22 타겟으로 부터 각각 5‘(siIE21) 및 3’(siIE23) 방향으로 2개 뉴클레오타이드씩 guide-strand의 타겟이 이동된 siRNA들을 추가로 포함하여 Ago2 재조합단백질을 사용한 타겟 절단 시험을 수행한 결과.
표 siIE21.5, siIE22, siIE22.5를 45% 혈장과 섞은 후 37℃에서 반응시킴.
표 C형간염바이러스 IRES를 지닌 reporter를 마우스 간에 전달한 후 siIE22 LNP를 0.1 mg, 1 mg/kg 용량으로 정맥 주사 하고 16시간 뒤 전달된 siRNA의 리포터 유전자 발현 억제 효과를 luciferase assay로 분석함
표 siIE22 LNP으로 제형한 후 인간의 간세포로 치환된 마우스(PhoenixBio)에 꼬리정맥을 통해 3일 간격으로 2회 1 mg/kg 농도로 주입.

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