< 연구개발사업의 목적 > · p53의 새로운 E3 ligase인 MKRN1의 조절기작 및 기능 확립. · NF-κB의 새로운 E3 ligase인 MKRN1의 조절기작 및 기능 확립. · MKRN1을 매개로 한 p53과 NF-κB 신호전달 체계의 cross-talk 모델을 확립. · MKRN1/p53/NF-κB의 상호작용이 암의 발생에 미치는 영향을 확립하고 이를 타겟으로 하는 새로운 항암치료법 제시
< 연구방법 > 1. MKRN1 knockdown 및 overexpression이 ce
< 연구개발사업의 목적 > · p53의 새로운 E3 ligase인 MKRN1의 조절기작 및 기능 확립. · NF-κB의 새로운 E3 ligase인 MKRN1의 조절기작 및 기능 확립. · MKRN1을 매개로 한 p53과 NF-κB 신호전달 체계의 cross-talk 모델을 확립. · MKRN1/p53/NF-κB의 상호작용이 암의 발생에 미치는 영향을 확립하고 이를 타겟으로 하는 새로운 항암치료법 제시
< 연구방법 > 1. MKRN1 knockdown 및 overexpression이 cell growth 및 intrinsic, extrinsic apoptosis 에 미치는 영향 확립 · Cell counting 및 crystal violet staining을 통해 cell growth 측정. · Adriamycin, Etoposide, UV irradation 등을 통한 intrinsic apoptosis 분석 · TNF, FAS, TRAIL 을 통한 extrinsic apoptosis 분석 · PI staining을 이용한 FACS analysis를 통해 cell cycle 분석. · FACS analysis (SubG1, Annexin V staining) 및 Western blot (caspases, PARP) 을 통한 apoptosis 측정.
2. MKRN1의 상호작용 스크리닝 및 확인 · Western blot 및 RT-PCR을 통한 관련 mRNA 및 단백질 측정 · Immunoprecipitation 및 GST-pull down assay를 통해 상호작용 확인 · Deletion mutant 를 이용한 상호작용 부위 확립
3. Ubiquitination 및 Degradation을 통한 MKRN1 타겟단백질 조절기작 확립. · Ubiquitination assay, Degradation assay, CHX treatment를 통한 조절기작 규명 · MKRN1 E3 ligase defective mutant를 사용한 ubiquitination 관련 여부 증명. · Deletion mutant 및 lysin mutant를 이용한 ubiquitination site 동정 및 기능 규명
4. In vivo에서 MKRN1이 암에 발생 및 성장에 미치는 영향 연구 · Data base 및 실제 암환자에서 MKRN1의 mRNA 및 protein 발현 여부 분석. · Xenograft model을 이용하여 MKRN1의 발현이 암세포의 성장에 미치는 영향 분석
< 연구결과 > 1. MKRN1이 cell growth에 미치는 영향 확립 및 조절기작 규명 · MKRN1은 p53, p21의 발현을 억제함으로써 G1 arrest 및 cell growth를 저해함. · MKRN1은 p53 및 p21과 직접 상호작용 함. · MKRN1의 p53과 p21의 ubiquitination 및 degradation을 유도함.
2. MKRN1이 p53-dependent apoptosis에 미치는 영향 확립 및 조절기작 규명 · MKRN1은 DNA damage에 의한 apoptosis를 촉진시킴을 확인. · DNA damage 하에서 MKRN1은 p53의 degradation은 유도하지 못하며, p21의 degradation을 유도함으로써 apoptosis를 촉진시킴.
3. MKRN1이 extrinsic apoptosis에 미치는 영향 확립 및 조절기작 규명 · MKRN1은 TNF, FAS, TRAIL에 의한 apoptosis를 억제함. · MKRN1은 FADD 단백질의 분해를 유도함으로써 death signal에 의한 DISC complex의 형성을 억제시킴. · MKRN1은 FADD와 직접 상호작용 하며 FADD의 ubiquitination 및 degradation 을 매개 함.
4. MKRN1의 암에 발생 및 성장에 미치는 영향 연구 · 암에서 MKRN1의 발현이 증가함 을 확인. · 암세포에서 MKRN1의 발현을 낮추었을 경우, 누드마우스에서 in vivo growth 가 늦어짐을 확임.
< 기대효과 > · 암의 발생에 관여하는 새로운 조절단백질(MKRN1)의 발견은 전반적인 암기작의 이해에 획기적인 근거를 제시할 것으로 기대함. · MKRN1을 매개로 한 p53 pathway와 extrinsic apoptosis pathway의 조절은 immune response, apoptosis, senescence의 관련성을 제공할 수 있는 새로운 암형성 메카니즘을 제시함. · 암세포의 특이적인 표적 물질을 발견하여 새로운 항암제 개발의 가능성을 제시하고, 논문 및 특허 등의 지적 재산권 확보를 통해 국가적 핵심기술의 국제경쟁력을 높일 것으로 기대됨.
(출처 : 연구개발사업 최종연구개발결과보고서 요약문 4p)
Abstract▼
< Purpose > · Establishment of mechanism and function of p53 regulation by MKRN1, a novel E3 ubiquitin ligase · Establishment of mechanism and function of NF-κB regulation by MKRN1, a novel E3 ubiquitin ligase · Establishment of tumorigenesis mechanisms based on the interaction of MKRN1 w
< Purpose > · Establishment of mechanism and function of p53 regulation by MKRN1, a novel E3 ubiquitin ligase · Establishment of mechanism and function of NF-κB regulation by MKRN1, a novel E3 ubiquitin ligase · Establishment of tumorigenesis mechanisms based on the interaction of MKRN1 with p53 and NF-κB, and to provide novel pathways for cancer treatment by targeting MKRN1-related pathway.
< Methods > 1. Effect of MKRN1 knockdown and overexpression on cell growth and intrinsic/extrinsic apoptosis · Analysis of cell growth by cell counting and crystal violet staining · Analysis of intrinsic apoptosis by treating cells with adriamycin, etoposide and UV · Analysis of extrinsic apoptosis by treating cells with TNF, FAS, TRAIL · Cell cycle analysis by PI staining and FACS. · Analysis of apoptosis by FACS analysis (SubG1, Annexin V staining) and Western blot (caspases, PARP).
2. Screening and confirmation of MKRN1-interacting protein · Analysis of mRNA and protein expression by Western blot and RT-PCR · Confirmation of protein-protein interaction by Immunoprecipitation and GST-pull down assay. · Mapping of interaction domainusing deletion mutant
3. Establishment of regulatory mechanism by which MKRN1 mediates ubiquitination and degradation of its target protein. · Establishment of regulatory mechanism through ubiquitination assay, degradation assay, CHX treatment. · Confirmation of MKRN1-mediated ubiquitination using E3 ligase defective mutant. · Identification of ubiquitination site using deletion mutant and lysin mutant
4. Effect of MKRN1 on cancer formation and development in vivo · Analysis of MKRN1 mRNA and protein expression from data base and cancer patient sample · Effect of MKRN1 on tumor growth using xenograft model
< Results > 1. Effect of MKRN1 on the cell growth and the mechanism by which MKRN1 regulates cell growth. · MKRN1 inhibits G1 arrest and induces cell growth by downregulating p53 and p21 expression. · MKRN1 diretly interacts with p53 and p21 · MKRN1 mediates the ubiquitination and subsequent degradation of p53 and p21.
2. Effect of MKRN1 on p53-dependent apoptosis and the mechanism by which MKRN1 regulates apoptosis. · MKRN1 facillitates DNA damage-induced apoptosis. · Upon DNA damage, p53 degradation by MKRN1 is prevented while MKRN1 degrades p21, thereby inducing apoptosis.
3. Effect of MKRN1 on extrinsic apoptosis and the mechanism by which MKRN1 regulates extrinsic apoptosis. · MKRN1 negatively regulates apoptosis induced by death ligand including TNF, FAS, and TRAIL. · MKRN1 abrogates DISC formation induced by death signaling through FADD degradation. · MKRN1 diretly binds to, ubiquitinates, and degrades FADD protein.
4. Effect of MKRN1 on the tumor formation and development · Protein and mRNA levels of MKRN1 is increased in tumor patient tissues. · Knockdown of MKRN1 in cancer cells inhibits tumor growth in nude mice.
< Expected Contribution > · The identification of MKRN1 as a new regulator for tumerigenesis is expected to provide new insight for cancer treamtent. · Particularly, since the extrinsic pathways are intimately related to immune response, we expect to find a new bridge that link tumorigenesis with chronic immune response. · These will further provide us with novel pathways that can be adapted for new drug development. · Overall, these studies will elucidate a new biochemical and physiological fields to pursue in the areas of apoptosis, aging process and tumorigenesis.
(출처 : Project Summery 6p)
목차 Contents
표지 ... 1제 출 문 ... 2목차 ... 3요약문 ... 4Project Summery ... 61. 연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 8 가. 연구개발대상 기술의 경제적․산업적 중요성 및 연구개발의 필요성 ... 8 나. 연구개발의 목표 및 내용 ... 172. 연구과제의 연구대상 및 방법 ... 183. 연구과제의 연구개발결과 ... 19 (1) MKRN1에 의한 p53,p21의 조절기작 ... 19 (4) TNF에 의한 apoptosis에서의 MKRN1-1의 역할 ... 26 (5) MKRN1의 in vivo 에서의 기능 연구 ... 324. 연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 345. 연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 36 (1) 연구성과 총괄 ... 36 (2) 연구성과 상세내역 ... 37 (3) 연구개발과제의 목표달성도 ... 496. 연구과제의 활용계획 ... 51 (1) 연구종료 3년까지 예상 연구성과 ... 51 (2) 연구성과의 활용계획 ... 517. 참고문헌 ... 528. 첨부서류 ... 53끝페이지 ... 56
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