초록 ▼

1. 연구개발사업의 목적
비정상적인 생체리듬과 유방암의 밀접한 관계가 다양한 역학적/임상적 연구결과로 알려지고 있으나, 이에 관여하는 분자적 기전에 대해 밝혀진 바는 미미함. 본 연구에서는 주요 유방암 표지자인 ERBB2 amplicon의 생체시계유전자인 NR1D1이 DNA damage response dynamics에 미치는 영향과 p53과의 cross-talk을 분석하고 그 분자세포생물학적 기전을 밝힘으로써 유방암 발생 및 진행에 대한 분자세포생물학적 이해를 도모하고자 하였음. 또한 NR1D1 과발현 및 저발현 세포주를 이

1. 연구개발사업의 목적
비정상적인 생체리듬과 유방암의 밀접한 관계가 다양한 역학적/임상적 연구결과로 알려지고 있으나, 이에 관여하는 분자적 기전에 대해 밝혀진 바는 미미함. 본 연구에서는 주요 유방암 표지자인 ERBB2 amplicon의 생체시계유전자인 NR1D1이 DNA damage response dynamics에 미치는 영향과 p53과의 cross-talk을 분석하고 그 분자세포생물학적 기전을 밝힘으로써 유방암 발생 및 진행에 대한 분자세포생물학적 이해를 도모하고자 하였음. 또한 NR1D1 과발현 및 저발현 세포주를 이용한 xenograft 모델에서 생체시계유전자가 DNA 손상 및 복구에 관여하는 발암성을 분석함으로써 궁극적으로 생체시계 유전자의 조절 정상화를 통한 항암 전략의 기반을 확립하고자 하였음.

2. 연구방법
1) DNA 손상 및 복구 측정법
◦ Comet assay, γH2AX foci 측정법 (Immunofluorescence), 8-OHdG 측정법 (형광관찰법 및 ELISA법), PARP activity 측정법, Chromatin immunoprecipitation (ChIP), FACS 방법, Microirradiation assay

2) DNA 손상에 대한 감수성 측정법
◦ MTT assay, Clonogenic survival assay, 3D matrigel culture MTT assay

3) DNA 손상 및 복구 관련 유전자 발현 패턴 분석 : Microarray 분석

4) DNA 손상 및 유방암 감수성에 대한 in vivo 연구 : In vivo mouse xenograft

5) 기타 생화학적 방법
◦ 유전자 과발현 방법 : DNA 또는 RNA transient transfection, 세포주 구축을 위한 stable transfection
◦ mRNA 및 단백질 발현 측정법 : qRT-PCR, Western blot
◦ 단백질 간 상호결합 분석법 : Immunoprecipitation, In situ proximity ligation assay (PLA)

3. 연구결과
1) 1차년도: 생체시계유전자 NR1D1이 DNA damage와 repair에 미치는 영향
◦ 유방암 세포주에서 NR1D1이 산화성 스트레스에 의한 DNA 손상을 증가시킴.
◦ Non-homologous end joining (NHEJ) reporter와 homologous recombination (HR) reporter 세포주에서 NR1D1이 DNA repair를 지연시킴.
◦ 인체 유방암 조직에서 높은 발현 NR1D1이 좋은 예후를 나타냄.

2) 2차년도: NR1D1이 DNA damage response (DDR) proteins의 dynamics에 미치는 영향
◦ 유방암 세포주에서 NR1D1이 DDR proteins의 DNA 손상 부위로의 recruitment를 지연시킴.
◦ NR1D1이 PARP-1과 상호결합하고, 산화성 스트레스에 의한 DNA 손상 시 결합이 증가함.
◦ NR1D1과 p53의 상호작용은 관찰되지 않음.
◦ NR1D1에 의해 조절되는 DNA damage response 관련 유전자 FBXO6, SP100, HMOX1, IFI16, NUPR1를 발굴함.
◦ NR1D1 저발현 세포주에서 NR1D1에 의해 H2O2 또는 paraquat로 유도된 DNA 손상에 대한 감수성이 증가함.

3) 3차년도: xenograft mouse model을 이용한 유방암 발생과 진행에서의 NR1D1 역할과 기능분석
◦ NR1D1 과발현 및 저발현 세포주에서 NR1D1에 의해 doxorubicin으로 유도된 DNA 손상에 대한 감수성이 증가함.
◦ NR1D1 과발현 및 저발현 세포주를 이용한 xenograft 모델에서 NR1D1에 의해 DNA damage 유도 약물 doxorubicin 투여 시 발암에 대한 감수성이 증가함.
◦ NR1D1 저발현 세포주를 이용한 xenograft 모델에서 NR1D1에 의한 ERa 신호계 활성 조절을 분석함.

4. 기대효과
◦ 생체리듬과 유방암 발생의 연관성을 분자세포생물학적 측면에서 이해함으로써 유방암의 발병기전과 생체시계유전자의 생리학적 기능을 밝힘
◦ NR1D1의 생체시계 시스템은 유방암 발생, 대사성 질환, 수면 장애로 인한 각종 인체 질환을 타깃으로 하는 효율적 약물 작용점으로 개발될 가능성 있음
◦ 핵 수용체의 새로운 생물학적 기능 및 조절 기작 규명
◦ 생체시계유전자를 표적으로 하는 타깃동정과 검증기술 개발로 국제 연구 경쟁에서 우위 선점함
◦ 선진화된 생명의약분야의 전문가 양성

( 출처 : 요약문 4p )

Abstract ▼

1. Purpose of the research
Although the association between abnormal circadian rhythm and the occurrence of breast cancer has being reported by the epidemiologic/clinic investigations, the molecular mechanisms connecting them are barely unknown. Here, we promoted the molecular cellular understand

1. Purpose of the research
Although the association between abnormal circadian rhythm and the occurrence of breast cancer has being reported by the epidemiologic/clinic investigations, the molecular mechanisms connecting them are barely unknown. Here, we promoted the molecular cellular understanding of breast cancer development and progression by demonstrating the roles of NR1D1, a circadian clock gene located at ERBB2 amplicon, a marker of breast cancer, in the DNA damage response dynamics, cross-talk between p53 and the molecular cellular mechanisms underlying them. In addition, we analyzed the role of circadian clock genes in the breast cancer development and progression in xenograft mouse model by using NR1D1 overexpressed and shNR1D1 stable cell lines. Eventually it will be a pharmacological foundation of anti-cancer drugs by normalizing the activity of circadian clock genes.

2. Methods
1) Analysis of DNA damage and repair
◦ Comet assay, analysis of γH2AX foci (Immunofluorescence), measurement of 8-OHdG levels (fluorescence microscopy and ELISA), analysis of PARP activity, Chromatin immunoprecipitation (ChIP), FACS, Microirradiation assay

2) Analysis of the sensitivity to DNA damage
◦ MTT assay, Clonogenic survival assay, 3D matrigel culture MTT assay

3) Analysis of the expression patterns of DNA damage response related genes
◦ Microarray analysis

4) In vivo study of DNA damage and breast cancer susceptibility : In vivo mouse xenograft

5) Other biological methods
◦ Gene expression : DNA or RNA transient transfection, Stable transfection for the construction of cell lines
◦ Analysis of the expression of mRNA or proteins : qRT-PCR, Western blot
◦ Analysis of protein-protein interaction : Immunoprecipitation, In situ proximity ligation assay (PLA)

3. Results
1) The 1st year : The effect of circadian clock gene, NR1D1, on the DNA damage and repair.
◦ NR1D1 increased oxidative stress-induced DNA damage in breast cancer cells.
◦ NR1D1 delayed DNA repair in non-homologous end joining (NHEJ) reporter and homologous recombination (HR) reporter cell lines.
◦ High levels of NR1D1 indicated a good prognosis in human breast cancer tissues.

2) The 2nd year : The effect of NR1D1 on the dynamics of DNA damage response (DDR) proteins.
◦ NR1D1 delayed the recruitment of DDR proteins to DNA break sites in breast cancer cells.
◦ NR1D1 was physically associated with PARP-1 and the association was increased in the presence of oxidative stress-induced DNA damage.
◦ Cross-talk between NR1D1 and p53 was not observed.
◦ We identified DNA damage response related genes FBXO6, SP100, HMOX1, IFI16, NUPR1 to be regulated by NR1D1 by microarray analysis.
◦ NR1D1 increased the sensitivity to H2O2 or paraquat-induced DNA damage in NR1D1 stable knockdown cell lines.

3) The 3rd year : Analysis of the role of NR1D1 in breast cancer development and progression by using xenograft mouse model
◦ NR1D1 increased the sensitivity to doxorubicin-induced DNA damage in NR1D1 stable overexpressed cell lines and NR1D1 stable knockdown cell lines.
◦ NR1D1 increased the susceptibility to doxorubicin in xenograft mouse model using NR1D1 stable overexpressed cell lines and NR1D1 stable knockdown cell lines.
◦ Regulation of ERɑ signaling activities by NR1D1 was analyzed in xenograft mouse model using NR1D1 stable knockdown cell lines

4. Expected impact
◦ Focusing on the physiologic functions of clock genes by identifying the relationship between circadian clocks and breast cancer development.
◦ Investigating the possibility of NR1D1 clock system to be developed as the efficient pharmacologic point targeting breast cancer, metabolic diseases and other diseases caused by sleep disorders.
◦ Discovering new biological function and the control mechanism of the nuclear receptors.
◦ Holding a dominant position in the international research competition by identifying the targets controlling clock genes and developing the verifying technique.
◦ Training the advanced biomedical professionals.

( 출처 : SUMMARY 6p )

목차 Contents

• 표지 ... 1제 출 문 ... 2목차 ... 3요약문 ... 4Project Summery ... 61. 연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 8 가. 연구배경 및 필요성 ... 8 나. 연구개발의 목표 및 내용 ... 132. 연구과제의 연구대상 및 방법 ... 19 가. 세포주 및 약물 ... 19 나. 발현 벡터 및 바이러스 ... 19 다. 유전자 과발현 방법 ... 20 라. mRNA 및 단백질 발현 측정법 ... 20 마. 단백질 간 상호결합 분석법 ... 20 바. DNA 손상 및 복구 측정법 ... 21 사. DNA 손상에 대한 감수성 측정법 ... 22 아. DNA 손상 및 유방암 감수성에 대한 in vivo 연구 ... 23 자. NR1D1 및 DNA 손상 및 복구 관련 유전자 발현 패턴 분석 ... 243. 연구과제의 연구개발결과 ... 25 1차년도 ... 25 2차년도 ... 37 3차년도 ... 704. 연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 85 가. 유방암에서 DNA 손상 및 복구 과정에서 NR1D1의 역할 및 분자 메커니즘 ... 85 나. 생체리듬 장애를 유방암으로 연계하는 인자로서의 NR1D1의 중요성 ... 87 다. 유방암 발생 및 진행에서의 NR1D1의 임상적 중요성 ... 88 라. 합성 리간드를 통한 유방암의 예방과 치료 약물의 개발 가능성 제시 ... 88 마. 연구과제의 결론 ... 895. 연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 91 (1) 연구성과 총괄 ... 91 (2) 연구성과 상세내역 ... 92 (3) 연구개발과제의 목표달성도 ... 946. 연구과제의 활용계획 ... 100 (1) 연구종료 3년까지 예상 연구성과 ... 100 (2) 연구성과의 활용계획 ... 1007. 참고문헌 ... 102끝페이지 ... 106