초록 ▼

< 연구 목적 >
· ERα 양성 유방암치료제 tamoxifen과 HER2 양성 유방암 치료제 herceptin (Trastuzumab) 등 표적 항암제들의 임상적용이 활발하나 암의 재발률은 꾸준한 증가세를 보여 재발 방지를 위한 새로운 치료적 접근법이 요구됨. 본 연구에서는 항암내성과 재발의 원인으로 알려진 휴지기 (Quiescence) 암세포를 줄기세포 배양법인 tumorsphere로 배양하여, 표적 유방암 치료제들의 항암활성과 세포조절 기전을 규명함으로써 효율적인 치료전략을 수립하여 항암내성 극복과 재발의 방지를 위한

< 연구 목적 >
· ERα 양성 유방암치료제 tamoxifen과 HER2 양성 유방암 치료제 herceptin (Trastuzumab) 등 표적 항암제들의 임상적용이 활발하나 암의 재발률은 꾸준한 증가세를 보여 재발 방지를 위한 새로운 치료적 접근법이 요구됨. 본 연구에서는 항암내성과 재발의 원인으로 알려진 휴지기 (Quiescence) 암세포를 줄기세포 배양법인 tumorsphere로 배양하여, 표적 유방암 치료제들의 항암활성과 세포조절 기전을 규명함으로써 효율적인 치료전략을 수립하여 항암내성 극복과 재발의 방지를 위한 임상학적 치료기술 개선을 최종목표로 함.

< 연구 방법 >
1. Tumorsphere Assay를 통한 휴지기 암세포의 배양 및 표적 유방암치료제들의 휴지기 암세포에 대한 항암활성의 재평가
· 각각의 다른 유방암 세포들로부터(MDA-MB-231, MCF-7, SK-BR-3) tumorsphere의 형성 확인 및 특징 분석
· ERα 양성 유방암 세포 MCF-7에서는 Tamoxifen, HER2 양성 유방암세포 SK-BR-3에서는 herceptin, Triple-negative 유방암세포 MDA-MB-231에서는 일반 항암제를 주축으로 휴지기 암세포에 대한 항암 활성을 평가
· 복합투여시의 효과 증가를 평가하기 위해 tumorsphere에서 효과적인 활성을 보인 일반 항암제를 표적 유방암 치료제와 함께 투여하여 활성을 평가

2. 표적 유방암치료제들의 휴지기 암세포에서의 표적 관련 signaling에 대한 조절기전의 비교, 분석 및 암줄기 세포 조절 기전에 미치는 영향 분석
· SK-BR-3의 tumorsphere에서 herceptin에 대한 내성기전을 HER-2 signaling에서 분석하고 tamoxifen과의 병합투여시 항암 활성 분석과 관련 세포 조절 기전 분석
· MDA-MB-231과 MCF-7의 tumorsphere에서 doxorubicin에 대한 내성기전을 분석하고 lapatinib과의 병합투여시 항암 활성 분석과 관련 세포 조절 기전 분석
· 암줄기세포의 대표적 조절 기전인 Wnt signaling에 미치는 영향을 분석하기 위해 MCF-7 세포에 TPA를 처리하여 PCK signaling 과 Wnt signaling의 상호 작용 분석

3. 표적 유방암 치료제와 일반 항암제와의 병합투여시의 항암활성을 동물 실험에서 평가
· 4T1 마우스 유방암 세포를 Bal/c 마우스에 이식한 후 metformin과 doxorubicin을 투여하여 항암활성 평가

< 연구 결과 >
· Tumorsphere assay에서 배양된 유방암 세포주들이 G0/G1의 휴지기 세포이며 tumorsphere로 배양된 휴지기 유방암세포들이 유방암환자의 표적치료제 및 일반 항암제에 강한 내성을 나타냄을 확인함. 이는 휴지기 세포를 효과적으로 제거할 수 있는 치료전략 수립의 필요성을 제시함

· 암줄기 세포의 대표적인 조절인자인 Wnt signaling과 PKC signaling의 상호작용을 MCF-7 세포에서 규명

· ER/PR/HER2발현이 없는 MDA-MB-231 유방암 세포에서 형성된 tumorsphere에서 항암제 내성이 나타나는 것을 확인하였고 이를 극복하기 위해 lapatinib을 병용투여한 결과 MRP-1의 발현 감소로 doxorubicin의 세포내 축적을 증가시켜 tumorsphere의 doxorubicin에 대한 항암내성을 감소시킴을 확인

· Doxorubicin에 대해 항암내성을 보이는 ERα양성인 MCF-7 유방암 세포의 tumorsphere에서 lapatinib의 병용치료시 ATP-binding cassette (ABC) drug transporter인 MDR-1과 BCRP를 저해해서 항암제의 항암활성을 증가시킴을 확인

· HER2가 과발현된 SK-BR-3 유방암 세포에서 형성된 tumorsphere가 HER2 표적치료제인 herceptin에 대해 항암 내성을 나타내고 이를 극복하기 위해 tamoxifen을 병용투여한 결과 non-genomic ER signaling 저해 및 EGFR/HER-2 과 AKT의 활성을 저해됨으로써 tumorsphere에 대한 herceptin의 항암활성을 증가함을 확인

· 4T1 마우스 유방암 세포의 tumorsphere의 항암제 내성을 확인하고 제2형 당뇨병 치료제인 metformin의 병용 투여시 doxorubicin의 항암활성이 증가함을 유방암 동물모델에서 확인하였고 그 기전이 AKT, p38 및 STAT3의 동시저해에 의한 것임을 세포실험을 통해 확인함

< 기대효과 >
· 본 연구에서는 기존 임상에서 사용하고 있는 유방암 치료제들을 대상으로 활성을 재평가하였을 뿐 만 아니라 각 유방암 표적 치료제들의 내성을 억제하고 항암 효과를 개선할 수 있는 방법으로 새로운 약물의 개발보다 기존 항암제들과의 효과적인 병합투여방법을 제시하였기에 이는 치료 기술 개선을 위한 임상적 응용이 가능하리라 예상함
· 기존 임상에서 사용하고 있는 유방암 치료제들을 대상으로 활성을 재평가함으로써 암줄기 세포 표적 신약 개발에 따르는 시간적, 경제적 비용 절감
· 기존 항암제들의 암줄기 세포 조절기전에 미치는 영향을 연구함으로써 향후 암줄기 세포의 특성을 조절하는 기전을 억제하는 물질을 찾는데 있어 초석을 제공할 것으로 예상함
· High-throughput assay로 개발되어진 tumorsphere assay를 통한 항암 활성 평가는 암환자의 암조직을 직접 이용하여 평가 가능함으로 개인 맞춤형 치료법 개발에 응용 가능
· 유방암의 재발원인 분석 및 진단에 대한 학술적 자료로 활용

(출처 : 연구개발사업 최종연구개발결과보고서 요약문 4p)

Abstract ▼

< Purpose >
· The quiescent state plays an important role in tumor recurrence because it protects cancer cells from chemotherapy. Previously, we optimized tumorsphere cultures for in vitro screening methods for targeting quiescent cell population since the majority of cells in tumorsphere are q

< Purpose >
· The quiescent state plays an important role in tumor recurrence because it protects cancer cells from chemotherapy. Previously, we optimized tumorsphere cultures for in vitro screening methods for targeting quiescent cell population since the majority of cells in tumorsphere are quiescent. Thus, we aim to seek better strategies for eradicating quiescent cell population by analyzing efficacies of current chemotherapeutics.

< Methods >
1. Cultivation of quiescent cells in tumorsphere assay and evaluation of cytotoxic effects of targeted therapy
· Characterization of tumorspheres generated from several human breast cancer cells (MDA-MB-231, MCF-7, SK-BR-3).
· Assess chemotherapeutic responses of cells transferred to monolayer or sphere culture with WST-8.
· Assess the combinational effect of targeted therapy with other chemotherapeutics.

2. Investigation mechanisms underlying chemoresistance in tumorsphres and establishment strategies to overcome chemoresistance
· Assess the combinational effect of the dual ErbB1/ErbB2 inhibitor, lapatinib, with doxorubicin in MDA-MB-231 or MCF-7 tumorspheres.
· After MCF-7 cells were treated with 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA) for up to 3 weeks, the contribution of PKC isoforms to Wnt signaling pathway in regulating cancer stem cells was investigated.
· Assess the combinational effect of tamoxifen with herceptin to overcome herceptin resistance in Her2-positive SK-BR-3 tumorspheres.

3. Evaluation of combinational effects of chemotherapeutics in animal models
· 4T1 cells were transplanted into fat pads of Balb/c mice and adminiseted metformin or doxorubicin after tumor were palpable.

< Results >
· Tumorspheres exhibited accumulations of cells in the G0/G1 phase as compared with cells in monolayer culture, as well as chemoresistance.

• PKC-Θ positively regulates the canonical Wnt signaling pathway, and that PKC-η and PKC-δ negatively modulate this signaling pathway in TPA -treated MCF-7 cells.

• Lapatinib sensitizes quiescent MDA-MB-231 breast cancer cells to doxorubicin by inhibiting doxo rubicin-induced MRP -1 expression via PI3K/ AKT and p38 MAPK signaling pathways.

• Inhibition of EGFR/HER2 signaling by lapatinib sensitized MCF-7 tumor spheres to doxortibicin by inhibiting the expression of the ABC transporters. MDR-1 and BCRP, and thus, enhancing the intracellular accumulation of doxorubicin.

• Tamoxifen enhances cytotoxic effects of herceptin in HER2-positive SK-BR-3 tumorspheres via blockade of non-classical genomic estrogen receptor α signaling pathway and EGFR/Her2 signaling pathway.

· Metformin, the first-line treatment for type 2 diabetes, efficiently suppressed chemoresistance observed in 4T1 tumorspheres.

< Conclusions >
• We expect that outcomes from this study will improve clinical response in treatment of breast cancer patients.

• Combinations of lapatinib and cytotoxic anticancer drugs may offer an advantage for treating the drug-resistant cancers.

• Herceptin treatment in combinat ion with tamoxifen cotild be a useful strategy to improve clinical response of HER2- positive breast cancers.

(출처 : Project Summery 6p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 목차 ... 3
• 요약문 ... 4
• Project Summery ... 6
• 1. 연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 1) 연구개발의 배경 및 필요성 ... 8
• 2) 연구개발의 목표 및 내용 ... 11
• 2. 연구과제의 연구대상 및 방법 ... 12
• 1) 연구 수행 범위 ... 12
• 2) 연구 수행 방법 ... 12
• 3) 연구과제의 연구개발 결과 ... 18
• 4. 연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 54
• 5. 연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 56
• 1) 연구성과 총괄 ... 56
• 2) 연구성과 상세내역 ... 57
• 3) 연구개발과제의 목표달성도 ... 60
• 6. 연구과제의 활용계획 ... 61
• 1) 연구종료 3년까지 예상 연구성과 ... 61
• 2) 연구성과의 활용계획 ... 61
• 7. 참고문헌 ... 62
• 8. 첨부서류 ... 63
• 끝페이지 ... 66