초록 ▼

연구의 목적 및 내용
본 연구에서는 벼도열병균의 YPEL과 GRAM 유전자에 대한 발병 및 병원성에 대한 기능 및 역할을 구명하였다. 1~2년차 연구의 주된 내용은 유전자 결실돌연변이체와 유전자복원돌연변이체를 만들어 포자생성을 포함한 생활사에서 기능을 밝히는 연구와 qRT-PCR 을 이용한 유전자의 발현양상을 연구하였다. 2~3년차 연구의 주된 내용은 형광단백질을 이용한 시간적, 공간적 발현 연구, 형광단백질을 이용한 세포 내 단백질 위치 연구, yeast two-hybrid 분석을 이용한 결합단백질 동정에 관한 연구를 수행하

연구의 목적 및 내용
본 연구에서는 벼도열병균의 YPEL과 GRAM 유전자에 대한 발병 및 병원성에 대한 기능 및 역할을 구명하였다. 1~2년차 연구의 주된 내용은 유전자 결실돌연변이체와 유전자복원돌연변이체를 만들어 포자생성을 포함한 생활사에서 기능을 밝히는 연구와 qRT-PCR 을 이용한 유전자의 발현양상을 연구하였다. 2~3년차 연구의 주된 내용은 형광단백질을 이용한 시간적, 공간적 발현 연구, 형광단백질을 이용한 세포 내 단백질 위치 연구, yeast two-hybrid 분석을 이용한 결합단백질 동정에 관한 연구를 수행하였다.

연구결과
벼도열병균의 yippee유전자(MoYPEL1, MoYPEL2)와 GRAM유전자(MoGRAM1, MoGRAM2)에 대한 각각의 유전자결실돌연변이체(knockout mutants)와 유전자복원형질전환체(complemented transformant)를 만들어 벼도열병의 생활사 전반에 걸친 다양한 실험을 통해 유전자의 기능을 구명하였다. 결실돌연변이체 ΔMoypel1과 ΔMogram1는 비정상적으로 균사생장이 느려졌고, 포자생성과정에서 ΔMoypel1과 ΔMogram1 그리고 ΔMogram2의 포자수가 심각하게 줄어드는 표현형을 보였다. 반면에 ΔMoypel2는 오히려 포자수가 증가하여 ΔMoypel1과 서로 상이적인 표현형을 보였다. 부착기생성 단계에서 ΔMoypel1, ΔMogram1 그리고 ΔMogram2가 소수성 표면에서 부착기를 형성하지 못하였다. 반면에 ΔMoypel2는 비정상적인 부착기를 더 많이 만들었다. 그리고 병원성 검정에서 ΔMoypel1, ΔMogram1 그리고 ΔMogram2는 기주식물체인 벼에 병을 일으키지 못하였다.

ΔMoypel2는 병은 일으켰으나 병원성이 줄어들었다. 이 결과로 4개의 유전자들은 벼도열병균의 생활사 전반에 걸쳐 발달과 병원성을 조절한다는 것을 알 수 있었다. 그리고 벼도열병균의 생활사 단계별 유전자의 발현양상을 분석하기 위해 균사, 포자, 발아포자, 부착기, 식물감염 단계에서 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하고 Real-time PCR를 이용하여 각각의 유전자가 생육단계별 어느 정도 발현하는지를 구명하였다. 그 결과 MoGRAM1과 MoGRAM2는 부착기와 식물감염 단계에서 발현이 증가되는 것을 볼 수 있었다. MoYPEL1은 모든 단계에서 발현이 증가하였으며, MoYPEL2는 포자, 부착기 단계에서는 발현이 억제되고 발아와 식물감염 단계에서는 증가하였다. 그리고 GRAM 유전자 2개의 promoter를 형광단백질(GFP)에 결합시켜 벼도열병균에 삽입시킨 후 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과 포자경(conidiophore)과 포자, 그리고 부착기에서 강하게 발현되는 것으로 나타났다. 또한 YPEL 유전자 두 개에 각각 GFP와 RFP를 tagged하여 관찰한 결과 포자의 핵과 부착기의 세포질과 핵에서 발현되었고, GRAM 유전자는 peroxisome은 vacuole로 들어가 분해되긴 하나 그 양이 wild type보다 현저히 적어 6시간이 지난 후에도 여전히 포자를 가득 채우지 못했고 세포질에 남아있었다.

연구결과의 활용계획
본 연구 결과는 연구가 부족한 포자생성 기전에 대한 연구로 학문적인 발전과 더불어 산업적 측면에서 시대 요구에 부응하는 새로운 병 방제기법 개발을 위한 기초 자료를 제공한다. 벼도열병균의 포자생성에 관한 연구는 어떻게 미생물이 환경을 인지하여 발달과 생존하는지를 분자생물학적, 유전학적으로 이해하는 것으로 학문적 가치가 높다. 이를 활용하여 논문, 특허, 연구 기술 등의 국제적 수준의 원천기술 확보가 가능하다. 또한, 벼도열병균은 전 세계적으로 벼를 생산하는 모든 국가에서 문제시 되는 병원균이며, 우리나라에서는 막대한 방제 비용이 지속적으로 소모되고 있으며, 후진국에서는 고가의 방제 비용으로 인한 방제회피로 쌀수확량에 막대한 손실을 초래하고 있다. 따라서 포자생성 억제 연구를 통한 새로운 방제기법 개발은 농약 시비 횟수를 줄여서 생산비 절감과 환경 보호 효과를 기대할 수 있다.

(출처 : 한글요약문 4p)

Abstract ▼

Purpose&contents
Understanding asexual reproduction, so called conidiation, is a priority since conidia are the major inoculum for disease cycles of many fungal pathogens. In this proposal, we will perform detailed molecular genetic and biochemical studies of subsets of gene families encoding Yip

Purpose&contents
Understanding asexual reproduction, so called conidiation, is a priority since conidia are the major inoculum for disease cycles of many fungal pathogens. In this proposal, we will perform detailed molecular genetic and biochemical studies of subsets of gene families encoding Yippee-like proteins and GRAM proteins that were identified from a previous microarray study during conidiation of Magnaporthe oryzae.

This research will increase our understanding of fungal development, and contribute to identifying potential targets for crop protection strategies.

Result
Deletion mutants of Yippee-like genes (MoYPEL1 and MoYPEL2) and GRAM genes (MoGRAM1 and MoGRAM2) and their complemented strains were generated by homologous gene replacement to investigate functional roles of the genes during fungal development and infection. The two deletion mutants ΔMoypel1 and ΔMogram1 showed reduction in mycelial grotwth. ΔMoypel1, ΔMogram1, and ΔMogram2 showed significant reduction in conidiation whereas ΔMoypel2 showed increased conidiation. On artificial hydrophobic surface, ΔMoypel2 formed aberrant appressoria while ΔMoypel1, Δ Mogram1 and ΔMogram2 did not form appressoria. In pathogenicity assay, ΔMoypel1, Δ Mogram1 and ΔMogram2 did not have pathogenicity in rice sheath. ΔMoypel2 had pathogenicity but showed reduced lesions. According to these results, we concluded that the four genes are related to the life cycle of M. oryzae and regulate pathogenicity. Next, we extracted RNA from the each stage of mycelial growth, conidiation, germination, appressorium formation, and infection to investigate gene expression rate. The extracted RNA were reverse transcripted into cDNA and quantitative real-time PCR was conducted. MoGRAM1 and MoGRAM2 were up-regulated in appressorium formation and infection stages. MoYPEL1 was up-regulated in all stages. MoYEPL2 was up-regulated in infection stage and down-regulated in conidiation and appressorium formation stages. Finally, we generated MoGRAM1p::GFP::HPH , MoGRAM2p::GFP::HPH, MoYPEL1p::GFP::HPH, and MoYPEL2p::GFP::HPH constructs and PCR-amplified the constructs. The PCR-amplified constructs were directly transformed to into M. oryzae. The MoGRAM genes were strongly expressed in conidia, conidiophore, and appressoria. MoYPEL1::GFP and MoYPEL1::RFP were expressed in the nuclei of conidia and the cytosol and nuclei of appressoria. In ΔMogram1 and ΔMogram2 GFP::SKL (peroxisomal sequence 1) was expressed in vacuole and degraded in there but the degradation was delayed than wild type and the vacuole that expressing GFP signal wasn’t full of conidia after 6 hours.

Expected Contribution
our study will provide basic information on M. oryzae conidiation which is relatively less studied and on the disease control technique that serves the needs of contemporary from the industrial view point. The study of conidiation in M. oryzae is useful to understand how to survive micro-organism in respect to molecular biology and genetics. Source technology such as research paper, patent, researching technology can be secured by the study of conidiation in M. oryzae. rice blast caused by M. oryzae is one of the most destructive diseases on worldwide and it causes tremendous annual yield losses of rice in Korea as well as other developing countries. Moreover, it is very costly to prevent rice blast disease. Therefore, it is expected to reduce the production cost of rice and prevent the environment by the studying of conidiation and new disease control technique.

(출처 : SUMMARY 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1목차 ... 2연구계획 요약문 ... 3연구결과 요약문 ... 4 한글요약문 ... 4 SUMMARY ... 5연구내용 및 결과 ... 6 1. 연구개발과제의 개요 ... 6 2. 국내외 기술개발 현황 ... 9 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 12 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 30 5. 연구결과의 활용계획 ... 31 6. 연구과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ... 32 7. 참고문헌 ... 33 8. 연구성과 ... 34 9. 국가과학기술지식정보서비스에 등록한 연구시설‧장비 현황 ... 40 10. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 41 11. 기타사항 ... 44끝페이지 ... 44