초록 ▼

연구의 목적 및 내용
본 연구의 목적은 류비저를 일으키는 류비저균(Burkholderia pseudomallei)의 heptose 생합성에 관계된 효소들을 타겟으로 하는 저해제의 개발이다. 류비저균은 그람음성균으로 사람에게 감염을 일으켜 폐렴이나 패혈증을 발병시킨다. 또한 높은 치사율과 항생제 내성 때문에 새로운 항생제의 개발이 필요하다. 일반적인 미생물에서 heptose 생합성의 저해는 세포막의 이상 현상으로 항생제에 매우 민감하게 되고 감염력이 없어진다. 따라서 heptose 생합성의 저해제는 뛰어난 항생제보조제로서 개발될

연구의 목적 및 내용
본 연구의 목적은 류비저를 일으키는 류비저균(Burkholderia pseudomallei)의 heptose 생합성에 관계된 효소들을 타겟으로 하는 저해제의 개발이다. 류비저균은 그람음성균으로 사람에게 감염을 일으켜 폐렴이나 패혈증을 발병시킨다. 또한 높은 치사율과 항생제 내성 때문에 새로운 항생제의 개발이 필요하다. 일반적인 미생물에서 heptose 생합성의 저해는 세포막의 이상 현상으로 항생제에 매우 민감하게 되고 감염력이 없어진다. 따라서 heptose 생합성의 저해제는 뛰어난 항생제보조제로서 개발될 수 있다.

본 연구팀은 heptose 생합성과정 저해제를 발굴하기 위하여 heptose 생합성과정에 참여하는 효소를 모두 분리, 동정하였다. 우선 구조기반 저해제 발굴을 위하여 이 효소들의 삼차원 구조를 X-ray 결정학 방법과 상동 모델링(homology modeling)을 통하여 얻은 후, 30만개의 화합물 라이브러리를 구축하여 in-silico docking을 이용한 저해제 스크리닝을 수행하였다. 또한 LC-MS를 통한 저해제 스크리닝 방법을 개발하여 천연물 및 저분자 화합물 라이브러리에 대한 저해제 스크리닝을 수행하였고, 이를 통해 GDP-heptose 생합성과정 저해물질을 발굴하였다. 이 저해물질과 저해물질의 이성질체를 분리 및 합성하여 저해활성을 확인하였고, 나아가 류비저균에 대한 살균력 측정을 수행 중에 있다.

연구결과
가. HldE1과 HldE2의 삼차원 구조 모델링 : 구조를 규명하기에 충분히 양질의 결정을 아직 얻지 못하여, 결정의 refinement를 수행하며 동시에 GOT방법을 이용한 상동 모델링을 수행하여 HldE1과 HldE2의 삼차원 모델 구조를 얻었다.

나. 류비저균의 heptose 생합성 과정 관여 단백질 저해제 스크리닝
(1) In-silico screening을 통한 GDP-heptose 생합성 과정 관여 효소 저해제 도출 : TktA, GmhA, GmhB, HldE1, HldD 단백질에 대해 30만개 화합물 라이브러리로 in-silico docking 연구를 수행하여, 100개의 후보물질을 발굴하였다. 이렇게 발굴한 화합물의 활성은 시판중인 시약인 경우 구입하여 활성을 측정하고, 그렇지 않은 경우 합성전문회사에 의뢰하여 실험을 수행 중에 있다.
(2) LC-MS를 통한 GDP-heptose 생합성 과정 저해제 스크리닝 방법 개발 : 이전 연구에서 개발한 LC-MS를 통한 단백질들의 효소활성 측정법을 이용하여 저해제 스크리닝 방법을 개발하였다.
천연물과 저분자 화합물 라이브러리를 스크리닝한 결과, GDP-heptose 생합성과정을 저해하는 천연물 니아졸(nyasol)을 발굴하였고, 그 타겟단백질이 HddC임을 확인하였다. 또한 니아졸의 이성질 체인 히노키레시놀(hinokiresinol)의 HddC에 대한 저해활성을 확인하였다.

다. Heptose 생합성 과정 저해제 분리와 합성 : 추가실험을 위하여 발굴한 니아졸을 분리하였다.
또한 니아졸의 이성질체인 히노키레시놀(hinokiresionl)을 합성하였다.

라. 저해제의 살균력 측정 : 니아졸과 히노키레지놀 등 발굴한 저해제들의 살균력을 측정하기 위하여 영국의 Exeter 대학의 Richard Titball 교수 연구팀과의 공동연구를 수행하고 있다.

연구결과의 활용계획
본 연구를 통하여 류비저균의 GDP-heptose 생합성 과정에 참여하는 HddC 단백질의 저해제를 발굴하였다. 따라서 저해제의 개량을 통해 류비저균에 작용하는 강력한 항생제 및 항생제 보조물질의 개발을 기대할 수 있다. 또한 HddC 유사 단백질을 가지는 다양한 미생물의 저해제를 개발할 수 있다. 학문적 측면에서 본 연구를 통하여 개발한 효소 활성 측정법과 저해제 스크리닝 방법은 heptose 생합성 과정의 유사 단백질을 가지는 다양한 병원성 그람음성균의 연구에 응용될 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 미생물의 heptose 생합성과정 저해제 스크리닝에 응용 할 수 있다.

(출처 : 한글요약문 5p)

Abstract ▼

Purpose&contents
The goal of this project is to develop inhibitors against enzymes included in the heptose biosynthesis pathway of Burkholderia pseudomallei which causes melioidosis. The B. pseudomallei infection causes sever pneumonia and sepsis shock. Since mortality from melioidosis septic sho

Purpose&contents
The goal of this project is to develop inhibitors against enzymes included in the heptose biosynthesis pathway of Burkholderia pseudomallei which causes melioidosis. The B. pseudomallei infection causes sever pneumonia and sepsis shock. Since mortality from melioidosis septic shock remains high despite appropriate antimicrobial therapy, the development of more effective antibiotics or antibiotic adjuvants is required. In the majority of gram-negative bacteria, defects in the biosynthesis of heptoses result in extreme susceptibility to antibiotics and a remarkable reduction in virulence.

To reach this goal, all of enzymes included in the heptose biosynthesis pathway of B. pseudomallei were purified and identified. The structures of these enzymes have been determined by X-ray crystallographic study and homology modeling and used as templates for the in-silico screening against the library of 300,000 chemicals. The new inhibitor screening method using LC-MS was developed and performed against the library of natural products and synthetic chemicals. We found that the natural product, nyasol inhibits the enzyme activity of HddC. We purified nyasol and synthesized its isomer hinokiresinol and identified the inhibition activity against HddC. Now, we have been testing the bactericidal activity of these compounds against B. pseudomallei.

Result
A. The homology modeling of three dimensional structure of HldE1 and HldE2 : Since the high quality crystal have not yet been obtained, we determined the model structure of HldE1 and HldE2 by homology modeling using GOT method.

B. Screening for finding inhibitors against heptose biosynthesis pathway of B. psuedomallei (1) In-silico screening : We established the library of 300,000 chemicals and performed in-silico docking against five enzymes, TktA, GmhA, GmhB, HldE1, HldD. We found 100 candidiates against each of these enzymes. We purchased commercially avaliable chemicals or ordered synthesis of chemicals to measure bactericidal activity of them.
(2) LC-MS based screening : We developed a LC-MS based inhibitor screening method against the heptose biosynthesis pathway. We performed the LC-MS based screening using the library consisted of natural products and synthesized chemicals, and found that nyasol inhibits the enzyme activity of HddC. Hinokiresinol, the isomer of nyasol, also inhibits the enzyme activity of HddC.

C. Purification of nyasol and synthesis of its isomer : In order to perform further experiments, we purified nyasol and synthesized its isomer hinokiresinol.

D. The bactericidal activity test : We have been testing the potent bactericidal activity of these compounds against B. pseudomallei with Prof. Rechard Titball’s bacterial pathogenesis research group at the university of Exeter in UK.

Expected Contribution
The potent inhibitors against HddC involved in the GDP-heptose biosynthesis pathway of B. pseudomallei have been found in this research. Since increasing antibiotics resistant pathogenic microbes, new antibiotics targeting unknown biosynthesis pathways await. Therefore, the compounds found in this study can be a template to develop novel and promising antibiotics against melioidosis together with other diseases caused by pathogenic microbes containing HddC or HddC homologs enzymes.

The assay method to screen target enzymes in this study is also applicable in the similar academic field searching for novel antibiotics targeting the heptose biosynthesis pathway or similar pathways specially contained in Gram-negative microbes.

(출처 : SUMMARY 6p)

목차 Contents

• 표지 ... 1목차 ... 3연구계획 요약문 ... 4연구결과 요약문 ... 5 한글요약문 ... 5 SUMMARY ... 6연구내용 및 결과 ... 7 1. 연구개발과제의 개요 ... 7 2. 국내외 기술개발 현황 ... 7 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 8 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 13 5. 연구결과의 활용계획 ... 13 6. 연구과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ... 14 7. 참고문헌 ... 14 8. 연구성과 ... 14 9. 국가과학기술지식정보서비스에 등록한 연구시설‧장비 현황 ... 18 10. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 18 11. 기타사항 ... 19끝페이지 ... 19