초록 ▼

□ 연구의 목적 및 내용
뇌세포 분화 및 변이에 따른 뇌종양 발병기전 연구 및 신약개발 연구에 적용되는 기반 연구수단인 중대형 동물모델을 개발하고자, 효율적인 유전자 재조합 기술을 통해 astrocyte specific 한 GFAP 프로모터 및 종양유발유전자(EGFRvIII, HrasV12) 도입 세포주를 확립하고, 체세포핵이식(SCNT) 기법을 적용한 뇌종양 질환모델 돼지를 생산하고자 함.

□ 연구결과
1) 고효율 유전자 재조합 기술 개발 및 뇌종양유발 유전자 삽입 세포주 확립
① 계대배양에 따라 비

□ 연구의 목적 및 내용
뇌세포 분화 및 변이에 따른 뇌종양 발병기전 연구 및 신약개발 연구에 적용되는 기반 연구수단인 중대형 동물모델을 개발하고자, 효율적인 유전자 재조합 기술을 통해 astrocyte specific 한 GFAP 프로모터 및 종양유발유전자(EGFRvIII, HrasV12) 도입 세포주를 확립하고, 체세포핵이식(SCNT) 기법을 적용한 뇌종양 질환모델 돼지를 생산하고자 함.

□ 연구결과
1) 고효율 유전자 재조합 기술 개발 및 뇌종양유발 유전자 삽입 세포주 확립
① 계대배양에 따라 비정상적인 핵형을 보이는 iPS세포는 공여세포 후보에서 제외하고, 동물모델로 적합한 유카탄 미니돼지로 품종선발하고 태아세포주를 수립하였음.
② 뇌종양 유발 유전자(EGFRvIII and HrasV12)를 선발하고, 뇌종양유발시스템(LCMV-^LoxPEGFP-Stop^LoxP-EGFRvIII-P2A-SV40LT-T2A-DsRed)을 구축하여 그 기능을 확인하였음.
③ 성상세포 특이적인 pGFAP-CreER-LoxP(pcDH-pigGFAP-CreER^T2-puro) inducible 벡터시스템을 gene cloning 기법으로 구축 완료하였음.

④ 구축된 시스템을 Cloud male #5 세포주에 각각 electroporation 기법과 lentiviral vector system으로 도입하여 PCR을 통해 유전체 도입 여부를 확인하였음.
⑤ 형질전환세포주에 도입된 Vector system을 Tamoxifen을 통해 활성화 시킨 후, immuno staining, tumor sphere assay를 통해 종양줄기세포 형성 능력을 확인하였음.

2) 전능성 제어기술 개발을 통한 체세포의 불완전한 역분화 개선
① 돼지난자의 체외성숙과정에 항산화제인 아연(Zinc)을 첨가하여 수여세포질의 질과 배아발달율을 향상시켰음.
② 배반포의 질에 따른 부착율을 분석하기 위해 배반포를 3단계(Early, Expanding, Hatched)로 나누어서 배양보조세포(MEF) 위에 올려주었음. expanding과 hatched 배반포가 early에 비해 높은 부착율을 보였음.
③ IVF, PA, iPS-SCNT배반포유래 배아줄기세포를 수립하였음.

3) SCNT 전능세포에서의 착상기전 분석을 통한 안정적 전능성 확보
① 난모세포의 체외성숙에 있어 난구세포와 공배양을 통해 In vivo와 유사한 환경을 만들어 줌으로써 효율적으로 형질전환 동물을 생산을 위한 체외성숙 시스템을 확립하였음.
② SCNT를 통해 생산한 SV40LT 형질전환 배아의 정상성 및 효율성을 IVC를 통해 평가하였음. 그 결과 삽입유전자를 추후 유도할 수 있도록 inducible system내로 삽입하기로 하였음.
③ 총 3개의 형질전환세포주를 확립하였고, SCNT후 배아발달평가를 통해 최적의 세포주를 선발하였음.
④ 난소, 자궁내막, 태반, 탈락막 등 많은 종류의 조직에 존재한다고 알려진 hrG-CSF를 체외성숙과정에 첨가하여 배아발달율을 향상시켰음.

4) 안정적 전능성 확보를 통한 뇌종양 질환모델 돼지 생산
① 개선된 IVM시스템으로 성숙시킨 양질의 돼지난자로 SCNT복제배아를 생산하였고, 대리모에 이식하였음.
② 뇌종양 질환모델연구를 위한 성상세포 특이적인 pGFAP-CreER^T2 inducible 형질전환복제 돼지 생산하였음.
③ GFAP가 발현되는 뇌에서 CreER^T2 가 강하게 발현되는 것을 PCR을 통해 확인하였음. 또한 면역염색기법을 통해 뇌조직에서 CreER^T2 및 EGFP의 발현을 확인하였음.
④ 대뇌와 소뇌에서 genomic DNA를 isolation 하여 semi-nested PCR 기법으로 확인한 결과, 4OH-TM을 처리한 TG돼지에서 Cre/loxP재조합이 일어나는 것을 확인하였음.

□ 연구결과의 활용계획
1) 신경특이적 pGFAP-CreERT2 inducible system도입된 세포주는 추후 신경계질환(알츠하이머,헌팅턴질환 등)모델생산에도 유용한 시스템으로 이용될 수 있음.
2) 돼지를 이용한 뇌종양질환모델은 신약개발이나 발병기전 연구에 있어 기존의 뇌종양 마우스 모델의 한계를 극복할 수 있는 유용한 모델임.
3) 최근 연구동향에 따른 뇌종양 하위유형 별 신경종양 미니돼지모델을 생산을 통해 항암제 저항성 재발 모델 생산 및 검증 시스템 구축을 위한 후속연구를 진행할 예정임.

( 출처 : 요약문 4p )

Abstract ▼

□ Purpose&contents
This study is designed to generate genetically engineered pigs which can be applied to the brain cancer model. In this study, the transfected cell lines, inducible-expressing brain cancer related genes (EGFRvIII and HrasV12) using by astrocyte specific pGFAP-CreERT2 inducible

□ Purpose&contents
This study is designed to generate genetically engineered pigs which can be applied to the brain cancer model. In this study, the transfected cell lines, inducible-expressing brain cancer related genes (EGFRvIII and HrasV12) using by astrocyte specific pGFAP-CreERT2 inducible system, will be produced, and then somatic cell nuclear transfer (SCNT) will be performed. We will investigate the affecting factors to obtain high efficiency through cutting-edge biotechnology techniques. At the final stage of the study, high efficient productive system of transgenic pigs with brain cancer will be established by improvements of SCNT techniques and scrutinized examination of implantation process of transgenic cloned pigs via controlling totipotency.

□ Result
1) Development of high-efficiency gene recombination technology and establish of TG cell line inserted brain cancer related genes
① iPS cells showing abnormal karyotype according to subculture cells were excluded from the donor cell candidate. Basic cell lines were established from fetal Yucatan miniature pigs. It is suitable to animal disease models.
② Establish of brain cancer inducible system(LCMV-(LoxP)EGFP-Stop(LoxP) -EGFRvIII-P2A-SV40LT-T2A-DsRed) using a selected brain cancer genes (EGFRvIII and HrasV12). Operation of the system has been confirmed in vitro.
③ Establish of astrocyte specific pGFAP-CreER-LoxP(pcDH-pigGFAP-CreERT2 -puro) inducible vector system was completed by gene cloning techniques.
④ The established system was introduced into the Cloud male #5 cell line using electroporation or lentiviral vector system and confirmed by PCR.
⑤ The vector system in transgenic cell lines were activated by tamoxifen. Then, it was confirmed that the tumor stem cell-forming ability by immuno staining and tumor sphere assay.

2) Improvement of incomplete reverse differentiation of somatic cell through development of a technique for controlling the totipotence
①The antioxidant zinc were added to IVM medium of porcine oocytes. It improves the rate of development and quality in the embryo cytoplasm.
②To analyze the relationship between the quality and the attachment rate of the blastocyst, the blastocyst divided in three stages(Early, Expanding, Hatched) was put on the mouse embryonic fibroblast cells. Expanding and hatched blastocysts showed a high attachment rate compared to early blastocysts.
③ Established of IVF, PA, iPS-SCNT blastocyst-derived embryonic stem cell lines.

3) Maintenance of stable totipotence through the analysis of the mechanisms of SCNT embryo implantation
① Oocytes was co-cultured with cumulus cells in IVM that environment was similar to in vivo. As a result IVM system for efficiently producing a transgenic animal has been established.
② Normality and efficiency of SV40LT transgenic embryos produced by somatic cell nuclear transfer were evaluated by in vitro culture.
③ Three TG cell lines were established. Among them, priority cell line was selected by evaluation of SCNT embryo development.
④ hrG-CSF is known to exist in many types of tissue such as ovarian, endometrium, placenta and decidua.It was added to the medium, improved the rate of embryo development.

4) Production of pig brain cancer models through maintenance of stable totipotence
① SCNT embryos were produced by improved IVM system. It was transferred in surrogate mothers.
② Astrocyte-specific pGFAP-CreER^T2 inducible transgenic pigs for brain disease model studies were produced.
③ It was confirmed by PCR that GFAP and CreER^T2 were strongly expressed in the brain. In addition, it was confirmed the expression of the EGFP and CreER^T2 from brain tissue by immunostaining.
④ Extraction of genomic DNA in the cerebrum and cerebellum, and confirmed by PCR. As a result, it was confirmed that Cre/loxP recombination was occurred in TG pig treated with 4OH-TM.

□ Expected Contribution
1) Astrocyte-specific pGFAP-CreERT2 inducible system can be used to produce a pig model for a central nervous system (CNS) diseases such as Alzheimer's and Huntington's disease.
2) Pig brain cancer model is a useful model in the drug development and pathogenesis studies to overcome the limitations of mouse models.
3) According to recent research trend, we are going to produce brain cancer subtype models, and will build a system to evaluate of anti-cancer efficacy.

( 출처 : SUMMARY 5p )

목차 Contents

• 표지 ... 1목차 ... 2연구계획 요약문 ... 3연구결과 요약문 ... 4 한글요약문 ... 4 SUMMARY ... 5연구내용 및 결과 ... 6 1. 연구개발과제의 개요 ... 6 2. 국내외 기술개발 현황 ... 7 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 10 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 109 5. 연구결과의 활용계획 ... 119 6. 연구과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ... 121 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 121 8. 참고문헌 ... 122 9. 연구성과 ... 123 10. 국가과학기술지식정보서비스에 등록한 연구시설‧장비 현황 ... 142 11. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 142 12. 기타사항 ... 142별첨1 ... 143별첨2 ... 158끝페이지 ... 204