초록 ▼

□ 연구의 목적 및 내용
기존의 유전자 전달체인 아데노바이러스 등에서 나타나는 부작용의 문제로 극복하기 위하여, 초음파와 미소기포의 공동화 (Cavitation)현상을 활용한 국지적/선택적 shRNA transfection 전달 방식을 연구 개발하며, 전달 효율 향상을 위한 미소 기포를 연구 개발하고, 관련 초음파 파라미터 (duty, intensity, pressure 등)를 최적화하며, 전달된 유전체의 발현 효율을 증진시키기 위한 HIFU의 활용을 연구하여, 유전체 전달 암치료에 새로운 방안 마련을 목표로 함
◦ 1차

□ 연구의 목적 및 내용
기존의 유전자 전달체인 아데노바이러스 등에서 나타나는 부작용의 문제로 극복하기 위하여, 초음파와 미소기포의 공동화 (Cavitation)현상을 활용한 국지적/선택적 shRNA transfection 전달 방식을 연구 개발하며, 전달 효율 향상을 위한 미소 기포를 연구 개발하고, 관련 초음파 파라미터 (duty, intensity, pressure 등)를 최적화하며, 전달된 유전체의 발현 효율을 증진시키기 위한 HIFU의 활용을 연구하여, 유전체 전달 암치료에 새로운 방안 마련을 목표로 함
◦ 1차 년도
1) 개발한 미소 기포와 기존의 조영제의 약물전달 기능 비교 분석 및 독성 연구
2) 구현된 시스템으로 in vitro 실험 및 파라미터 정립
3) 종양세포주를 대상으로 정립된 파라미터를 이용하여 ANT2 shRNA를 도입
◦ 2차 년도
1) 구현된 시스템으로 동물 실험을 통한 파라미터 재정립 (환경적 변화 요소 포함)
2) 기존의 transfection agent와 미소기포 및 초음파 조영제들 간의 생체 내 독성 비교 연구
◦ 3차 년도
1) 동물 실험용 HIFU 시스템 개발 및 구현
2) ANT2 shRNA transfection 효과와 HIFU 간의 synergistic 효과 연구

□ 연구결과
◦ 1차 년도
1) 유전자 전달을 위한 Lipid shell 미소 기포가 제작되었으며 입도 분석 및 현미경 영상 등 다양한 평가 방법을 이용하여 제작된 미소기포의 특성이 평가됨
2) Hela cell과 초음파를 이용하여 in-vitro상에서 유전자 전달 조건 정립
3) 제작한 기기의 설계 시뮬레이션과 측정치와의 비교 평가 및 정상적인 작동 유무 확인 완료
◦ 2차 년도
1) 초음파에너지에 의한 DNA vector의 formation 변화를 정량적으로 평가. 초음파에 의해 packing된 DNA를 이용한 유전자 도입 결과 도입 효율의 증가를 확인
2) in-vitro상에서 정립된 초음파 조건을 기준으로 pEGFP벡터를 IV를 통해 주입한 후 초음파을 조사한 특정 부위에서의 발현 정도를 western blot을 이용하여 확인 및 in-vivo상에서의 초음파 조건 정립
◦ 3차 년도
1) In-vivo 실험 수행시 혈액 내 DNase 및 RNase에 의한 유전자의 손상을 보호하기 위한 미소기포의 encapsulation 기술 개발
2) In-vitro 실험을 통해 미소 기포로 encapsulation된 유전자가 DNase, RNase로부터 보호됨을 확인
3) 다양한 초음파 에너지에 의한 DNA vector의 formation 변화를 정량화하고 시간의 변화에 따른 formation 변화를 추적

□ 연구결과의 활용계획
◦ 본 과제에서는 암치료 목적으로 ANT2 shRNA의 선택적 전달로 제한되었으나 개발된 기술은 다양한 유전자 및 고분자 약물의 전달에 적용이 가능
◦ 암치료에 따른 국내 직간접적 비용은 2009년도 이미 14조원을 넘어 국가적 경제 비용이 증가됨. 본 과제의 연구 결과 유전자를 대상으로 특정 위치의 암세포 치료 효율 증대 기대
◦ 초음파에 의한 유전자의 supercoiled form을 유도하여 보다 작은 크기의 유전자를 이용한 유전자 전달이 가능해졌으며 유전자 효율을 높일 수 있는 방안으로 활용
◦ 유전자 protection이 가능한 미소 기포 개발은 앞으로 암 치료에 활용되는 모든 유전자에 적용할 수 있으며 초음파와의 반응성을 활용하여 비 침습적으로 국소적인 부위에 targeting 하여 유전자를 전달할 수 있는 새로운 유전자 전달의 방법으로 사용가능
(출처:요약문 5p)

Abstract ▼

□ Purpose& contents
In order to overcome obstacles related to adenovirus gene delivery, ultrasound mediated gene delivery was developed in this project. A specialized microbubble was designed to encapsulate shRNA and protect till release point, and ultrasound parameters was evaluated for the purp

□ Purpose& contents
In order to overcome obstacles related to adenovirus gene delivery, ultrasound mediated gene delivery was developed in this project. A specialized microbubble was designed to encapsulate shRNA and protect till release point, and ultrasound parameters was evaluated for the purpose of optimization. Additionally, synergic effect of gene therapy and high intensity focused ultrasound (HIFU) was verified. Finally, we suggest a new gene delivery system using ultrasound and microbubble.
◦ Year 1
1) Toxicity test and gene delivery effect evaluation of the developed microbubble
2) Implementation of ultrasound system and optimization using in vitro test
3) ANT2 shRNA delivery on the tumor cell
◦ Year 2
1) Recalibration the system for animal experiment
2) comparative toxicity evaluation of transfection agent, and the developed microbubble
◦ Year 3
1) HIFU system for animal experiment
2) synergic effect of ANT2 shRNA transfection and HIFU

□ Result
◦ Year 1
1) A lipid shell microbubble was designed for gene delivery and its characteristics was quantitatively evaluated.
2) Ultrasound parameters was established using Hela cell (in vitro_
3) Ultrasonic system design and evaluation
◦ Year 2
1) DNA packing with low energy ultrasound (world first)
2) pEGFP vector delivery with ultrasound on animal model
◦ Year 3
1) Development of echogenic liposome which can encapsulate genetic material
2) Verification of protective effect of the developed echogenic liposome
3) DNA vector formation control with ultrasound

□ Expected Contribution
◦ Originally, the purpose of this project focused on the ANT2 shRNA delivery, but the developed technique is not necessarily limited to that. This technology can be applied with various gene and large molecular drugs for cancer therapy.
◦ We expect this development can provide a means for spatially targeted cancer therapy.
◦ DNA can be further packed with controlled ultrasound, and this method is expected to increase gene trasnfectin efficiency.
◦ The protective function of the developed echogenic liposome may be widely used for various cancer therapy combined with focused ultrasound system.
(출처:SUMMARY 6p)

목차 Contents

• 표지 ... 1목차 ... 3연구계획 요약문 ... 4연구결과 요약문 ... 5 한글요약문 ... 5 SUMMARY ... 6연구내용 및 결과 ... 7 1. 연구개발과제의 개요 ... 7 2. 국내외 기술개발 현황 ... 16 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 21 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 50 5. 연구결과의 활용계획 ... 54 6. 연구과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ... 55 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 56 8. 참고문헌 ... 57 9. 연구성과 ... 58 10. 국가과학기술지식정보서비스에 등록한 연구시설.장비 현황 ... 64 11. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 64 12. 기타사항 ... 65별첨1 대표적 연구실적 요약문 ... 66별첨2 대표적 연구실적 사본 ... 67별첨2 세부 목표 관련 증빙 ... 96끝페이지 ... 128