초록 ▼

○ STR 분석기술의 감도 향상을 위한 기반기술 개발

○ MiniSTR 분석기술 및 마커 개발
· 총 18개의 miniSTR 마커를 선정하여 마커를 동시에 분석하기 위해 6개의 multiplex system을 자체적으로 확립.

· 이러한 miniSTR multiplex system의 개발은 기존의 일반적인 STR system으로는 분석이 불가능한 손상된 인체시료에서도 분석이 가능함.

· 개발된 miniSTR kit는 증폭산물의 size의 범위가 상용화된 MiniFiler kit(Applie

○ STR 분석기술의 감도 향상을 위한 기반기술 개발

○ MiniSTR 분석기술 및 마커 개발
· 총 18개의 miniSTR 마커를 선정하여 마커를 동시에 분석하기 위해 6개의 multiplex system을 자체적으로 확립.

· 이러한 miniSTR multiplex system의 개발은 기존의 일반적인 STR system으로는 분석이 불가능한 손상된 인체시료에서도 분석이 가능함.

· 개발된 miniSTR kit는 증폭산물의 size의 범위가 상용화된 MiniFiler kit(Applied Biosystems)에 비해 월등히 작기 때문에 더욱 유용함.

· 앞으로 6개의 miniSTR multiplex system을 1개의 miniSTR multiplex system으로 통합된 kit로 개발이 완성되면 외국 유전자 kit을 대체하는 효과가 기대됨.

○ 고감도 고안정성을 갖춘 반도체 및 실리카 나노입자에 기초한 STR 분석기술 감도 향상
· Quantum Dot이 표지된 PCR product를 이용하여 Quantum Dot이 더 많이 표지된 PCR Product의 발광세기가 증가함을 확인.

· 실리카 나노입자의 흡광 및 형광 스펙트럼 관찰을 하였으며 발광세기의 반감을 시간에 따라 형광스펙트럼의 관찰을 통해 확인.

· Biotin이 표지된 TH01 Ladder PCR product에 streptavidin labeled Polystyrene bead를 결합시킴.

· DNA 마이크로 어레이 칩을 이용한 STR 고감도 검출을 위한 DNA 마이크로 어레이 칩을 제작함.

· DNA 마이크 어레이 칩을 이용한 TH01 DNA hybridization을 통하여 FAM conventional 형광 색소에 비해 Quantum dot 나노입자를 이용할 경우 감도가 향상되는 것을 관찰함.

○ 신원확인 및 친자확인을 위한 SNP 마커 개발
· 대용량 SNP chip에 대한 효과적 분석방법을 정립하고 23,8304개의 SNP에 대한 분석을 완료하였음.

· 중국인, 일본인 및 서구인과 인종 구분이 가능한 SNP 210개 개발, 체계적인 선정기준에 따른 표준 선정과정을 확립하고 유효 SNP 마커 4,610개를 선정하였음.

· MAF 0.4-0.5 이면서 LD관계가 없는 SNP 마커와 중국인, 일본인 및 서구인에서 적용 가능한 SNP 200개 개발하였음.

· 최종적으로 개발된 92개의 SNP 마커 set에 대한 validation 및 verification 시험을 통해 기존의 STR system을 대체할 수 있는 차세대 DNA 마커로 탁월함이 입증되었음.

(출처 : 보고서 요약서 3p)

Abstract ▼

We were analyzed 18 miniSTR loci using six multiplex PCR systems (multiplex I: D1S1677, D2S441 and D4S2364; multiplex II: D10S1248, D14S1434 and D22S1045; multiplex III: D12S391, D16S3253, and D20S161; multiplex IV: D3S4529, D8S1115 and D18S853; multiplex V: D6S1017, D11S4463 and D17S1301; multiplex

We were analyzed 18 miniSTR loci using six multiplex PCR systems (multiplex I: D1S1677, D2S441 and D4S2364; multiplex II: D10S1248, D14S1434 and D22S1045; multiplex III: D12S391, D16S3253, and D20S161; multiplex IV: D3S4529, D8S1115 and D18S853; multiplex V: D6S1017, D11S4463 and D17S1301; multiplex VI: D5S2500, D9S1122 and D21S1437) in 227 unrelated individuals from Korea. The Exact Test demonstrated that all loci surveyed here were found to be no deviation from Hardy-Weinberg equilibrium, except three miniSTR markers (D4S2364, D5S2500 and D16S3253). The combined probability of match calculated from 18 miniSTR loci was 6.19 х 10^-17, which is high degree of polymorphism. Thus, this miniSTR system may be suitable for recovering useful information in analyzing degraded DNA samples.

Improvement of detection sensitivity for STR DNA genotyping identification is a highly sought-after, but challenging research area. High detection sensitivity is needed particularly for limited or small quantity of real world samples, such as samples collected from blood or hair from accident victims. Amplification of DNA for reliable DNA genotyping and further research consume a large volume of PCR reactants and time as well. In view of this, we tried to develop analytical methods that would offer much higher sensitivity for STR detection over the conventional fluorescence-based technique. To attempt the challenge of increasing the detection sensitivity of fluorescence-based techniques we conveniently chose two fluorescent nanoparticle systems - the semiconductor-based quantum dots and dye doped silica nanospheres that are known to offer much higher fluorescence quantum yield with excellent photostability over the conventional organic dyes (fluorephores).

ZnS-capped CdSe semiconductor naoparticles, popularly known as quantum dots (QDs), are usually 20 times brighter and ~100 times more resistant to photobleaching than organic fluorophores, and are commercially available. Dye doped silica nanoparticles (SiNPs) (20~200nm) which can be prepared using reverse microemulsion method also provide higher fluorescence quantum yield and excellent photostability. Therefore, quantum dot and silica nanoparticle were expected to increase the detection sensitivity of STR genotyping.

In the first year, the spectral properties (absorption and emission characteristics) and electrophoretic behavior of quantum dots with different size were investigated. PCR amplification products were successfully labeled with quantum dots labeled, and the detection sensitivities of slab-gel and capillary electrophoresis were compared using the QD-labeled PCR products. In the second year dye doped silica nanoparticles were synthesized in water-in-oil reverse microemulsion system. TEM observation confirmed the narrow size distribution of the synthesized SiNPs. Spectral characteristics (absorption and emission) and photostability of the SiNPs were investigated in detail. The SiNP surfaces were modified streptavidin to facilitate the conjugation with biotinylated PCR product. Streptavidin-coated dye-loaded polystyrene microbeads, that have higher quantum yield and excellent photostability, were used to label the biotinylated PCR product. However, unfortunately the dye inside the SiNPs and microbeads leaked out and migrated at a faster rate under an applied electric field. Moreover, the electrophoretic mobilities of silica nanoparticles and polystyrene beads were found to vary widely even within a narrow size distribution. These findings compelled us to conclude that these materials are not suitable as fluorophores in gel and capillary electrophoresis. In the third year, we developed a microchip-based sequence specific hybridization assay for STR DNA genotyping detection. Detector DNA was labeled with both QDs and conventional dye such as FAM. The obtained results showed the increase of detection sensitivity using QD-labeled detector oligonucleotides compared to conventional dye-labeled detector oligonucleotide. We have achieved to develop and optimize a PCR protocol for TH01 amplification that requires lesser amount of PCR ladder than the established protocols. We expect that this PCR protocol will be helpful in greater amplification of real world DNA samples. We also expect that fabricated dye doped silica nanoparticles, though not worked out per expectation for this particular project, can be used for other applications like imaging analysis of bio-materials.

We analyzed the Affymetrix Genomo-Wide Human SNP array 500K in 70 health peoples. Then candidate SNPs for forensic analysis which selected as following criteria : MAF about 0.5, genotype distribution 1:2:1 in Korean and HapMap population, non LD　and located in intergenic region. The final assay consisted of the 4 sex marker and 88 autosomal SNPs with representation on each chromosome. The validated assay has a PI of 3.6x10^-37 and the mean match probability was at least 99.99999933% . These 92 SNPs constitute excellent candidates for the global forensic community to consider for a universally applicable SNP panel for human identification.

(출처 : SUMMARY 9p)

목차 Contents

• 표지 ... 1제 출 문 ... 2제 출 문 ... 2보고서 요약서 ... 3요 약 문 ... 5SUMMARY ... 9CONTENTS ... 11목차 ... 12제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 13제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 16제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 19 제 1 절 MiniSTR 분석기술 및 마커 개발 ... 19 제 2 절 고감도 고안정성을 갖춘 반도체 및 실리카 나노입자에 기초한 STR 분석기술 감도 향상 ... 32 제 3 절 신원확인 및 친자확인을 위한 SNP 마커 개발 ... 40 제 4 절 투고 논문 실적 ... 47제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 49제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 58 제 1 절 MiniSTR 분석기술 및 마커 개발 ... 58 제 2 절 고감도 고안정성을 갖춘 반도체 및 실리카 나노입자에 기초한 STR 분석기술 감도 향상 ... 59 제 3 절 신원확인 및 친자확인을 위한 SNP 마커 개발 ... 59제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 60 제 1 절 MiniSTR 분석기술 및 마커 개발 ... 64 제 2 절 고감도 고안정성을 갖춘 반도체 및 실리카 나노입자에 기초한 STR 분석기술 감도 향상 ... 65 제 3 절 신원확인 및 친자확인을 위한 SNP 마커 개발 ... 66제 7 장 참고문헌 ... 67끝페이지 ... 72