초록 ▼

알츠하이머병의 원인으로 추측되는 가설 중의 하나인 이상단백질 축적설은 베타-아밀로이드(β-amyloid)라는 40~42개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드가 과도하게 만들어져 뇌세포에 축적되면,뇌의 신경세포 기능이 떨어져서 알츠하이머병이 발생한다고 추정하고 있다. 베타-아밀로이드는 신경세포내 미토콘드리아의 기능을 마비시키거나 왜곡시켜 미토콘드리아에서 배출되는 활성산소를 증가시키게 된다. 이렇게 증가된 활성산소는 세포 내 단백질이나 DNA에 치명적인 상처를 입히게 되고 결국 뇌세포의 손상 또는 세포사(apoptosis)를 초래한다고

알츠하이머병의 원인으로 추측되는 가설 중의 하나인 이상단백질 축적설은 베타-아밀로이드(β-amyloid)라는 40~42개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드가 과도하게 만들어져 뇌세포에 축적되면,뇌의 신경세포 기능이 떨어져서 알츠하이머병이 발생한다고 추정하고 있다. 베타-아밀로이드는 신경세포내 미토콘드리아의 기능을 마비시키거나 왜곡시켜 미토콘드리아에서 배출되는 활성산소를 증가시키게 된다. 이렇게 증가된 활성산소는 세포 내 단백질이나 DNA에 치명적인 상처를 입히게 되고 결국 뇌세포의 손상 또는 세포사(apoptosis)를 초래한다고 생각되어지고 있다. 이 질병의 원인으로 추정되는 베타-아밀로이드는 β-secretase와 γ-secretase라 불리는 프로테아제에 의해 베타-아밀로이드 전구체 단백질의 베타 부위와 감마 부위가 절단되어 생성된다. 이 프로테아제들은 알츠하이머병의 치료제 개발에 중요한 표적단백질로 생각되어지고 있다. 최근까지 알츠하이머병의 치료제는 알츠하이머병의 진행 속도를 완화시키거나 정지시킬 수 없기 때문에 알츠하이머병의 근본적 치료제가 될 수는 없다. 따라서 본 연구에서는 국내연안에서 자생하는 해양생물로부터 알츠하이머성 치매 억제 효과를 나타내는 물질을 분리‧정제하고 그 작용 메카니즘을 해명함으로서 알츠하이머성 치매 치료제를 위한 새로운 소재물질을 찾는 것을 목표로 하였다.
알츠하이머병의 발병에 중요한 BACE1 및 BACE2을 대량생산하기 위하여 대장균에서 손쉽게 발현 가능한 발현 벡트 (pET11, pGEX 등)를 유전공학적인 수법을 이용하여 BACE1/BACE2의 다양한 발현계를 구축 하였다. 그 결과 pET11/BACE1 발현벡터는 pGEX-4T/BACE1 발현벡터 보다 BACE1 프로테아제의 발현량이 월등한 것으로 확인되었다. BACE1의 단백질 발현은 pET11a/BACE1을 형질전환시킨 대장균 BL21(DE3)로 대량배양하여 inclusion body(침전물) 회수한 후, rapid dilution 방법을 사용하여 BACE1 단백질을 refolding시켰다. 리폴딩한 단백질은 ultrafiltration으로 농축하여, Sephacry S-300 column 및 Resource-Q로 완전 정제하였다. 이상의 과정을 통해 정제한 BACE1은 효소활성을 충분히 가지고 있을 뿐만 아니라 정제도 측면에서도 약 95%이상 순수하였다. 또한 완전 정제된 BACE1프로테아제의 N-말단 아미노산 배열 분석 및 MALDI-TOF mass를 측정한 결과, 예상한 BACE1프로테아제의 N-말단 아미노산 배열 및 분자량이 정확히 일치하는 것으로 확인되었다. BACE2의 효소의 발현벡타 구축 및 대량생산은 BACE1과 유사한 방법으로 발현벡터를 구축하고, 유사한 단백질 정제과정을 통하여 BACE2 효소를 완전정제하여 4℃에 보관하면서 효소의 특성실험 등에 사용하였다. BACE1 &2의 기질특이성을 확인하기 위하여 다양한 합성펩타이드(NCH-γ, APP -α, APP-β, swAPP-β, APP-γ, ENK-1,Insuline B chain, Kine- tensin, Mastoparan, Neuropeptide)를 구입 및 합성하여 기질 특이성을 분석하였다. 그 결과 BACE1 및 BACE2 프로테아제 모두는 APP-β 와 swAPP-β의 β-secretase 인식부위인 M/D 뫄 L/D를 절단하였으나 APP-γ 기질 인식부위는 절단하지 못하였다. 다양한 합성펩타이드를 사용한 결과 BACE2의 기질 인식 특이성은 브로드 한 것으로 확인되었다.
해조류 추출물의 BACE1의 효소활성에 대한 저해효과를 탐색하기 위하여 감태, 톳, 다시마, 미역귀, 김의 추출물을 각각 DMSO/EtOH/DDW에 녹여 BACE1의 효소활성 측정 시 적당량 첨가하여 효소저해효과를 측정하였다. 그 결과 감태를 비롯하여 톳, 다시마, 미역귀의 70% 메탄올 추출물에서 BACE1의 효소활성을 저해하는 물질이 존재하는 것으로 확인되었다. 특히 감태 추출물의 BACE1의 효소저해활성이 가장 높은 것으로 나타났다. 또한 70% 에탄올 추출물에서는 미역귀 추출물에서는 효소저해활성이 확인되지 않는 반면에 감태와 톳의 추출물에서는 확연히 BACE1의 효소활성을 저해하는 물질이 존재하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 감태 및 톳에 내포되어있는 BACE1의 효소활성을 저해하는 물질을 규명하기 위하여 계속적으로 실험을 진행하고 있을 뿐만 아니라, 감태에 존재하는 생리기능성물질로 잘 알려져 있는 에콜 및 디에콜 등의 물질을 분리􌝆정제하여 BACE1 효소활성 저해효과에 관하여 실험을 진행 중에 있다.
(출처:요약문 3p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 2
• Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 3
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 4
• 1. 연구과제의 개요 ... 4
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 4
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 5
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 7
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 7
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 7
• 끝페이지 ... 7