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Kafe 바로가기주관연구기관 | (주)대덕바이오 |
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 | 한국어 |
발행년월 | 2015-12 |
과제시작연도 | 2014 |
주관부처 | 농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 | TRKO201600003425 |
과제고유번호 | 1545008396 |
사업명 | 고부가가치식품기술개발 |
DB 구축일자 | 2016-07-02 |
DOI | https://doi.org/10.23000/TRKO201600003425 |
Ⅴ. 연구개발결과
본 연구 과제를 성공적으로 수행하여 다음과 같은 주요 연구기술 및 제품을 개발하였다.
① 흑삼의 표준화 제조공정 확립
기존의 흑삼 제조방법은 구증구포 방식으로 제조시간이 오래 걸리고, 잘못 증숙하게 되면 인삼이 탄화되어 발암물질인 벤조피렌 성분이 생성되는 문제점들이 발견되었다. 본 연구는 인삼 성분의 물리·화학적 전환원리를 과학적으로 적용하여 제조시간을 단축시키고, 유효 특정사포닌 성분 함량을 극대화한 흑삼을 다량 제조할 수 있는 방법을 개발하여 특허등록을 완료하였다. 종래의 흑삼 제
Ⅴ. 연구개발결과
본 연구 과제를 성공적으로 수행하여 다음과 같은 주요 연구기술 및 제품을 개발하였다.
① 흑삼의 표준화 제조공정 확립
기존의 흑삼 제조방법은 구증구포 방식으로 제조시간이 오래 걸리고, 잘못 증숙하게 되면 인삼이 탄화되어 발암물질인 벤조피렌 성분이 생성되는 문제점들이 발견되었다. 본 연구는 인삼 성분의 물리·화학적 전환원리를 과학적으로 적용하여 제조시간을 단축시키고, 유효 특정사포닌 성분 함량을 극대화한 흑삼을 다량 제조할 수 있는 방법을 개발하여 특허등록을 완료하였다. 종래의 흑삼 제조방식은 주로 구증구포 제조 방법을 이용하여 원료인삼을 9번 증숙하고 말리는 과정을 거쳐 제조되어 왔으며, 제조규모 시설에 따라 약 18일 이상이 소요될 뿐 아니라 반복되는 증숙 과정중에 가용성 엑스성분이 용출되어 흑삼 제조수율이 약 25.4%로 저조하고 신맛, 텁텁한맛 및 쓴맛이 강하여 향미에 문제점이 있어 이에 대한 개선책이 우선적으로 요구되었다. 이와 같은 문제점 개선을 위하여 60 ~ 98℃ 범위의 증숙 과정을 반복하여 흑삼을 제조한 결과, 80℃ 제조구의 품질 및 제조수율이 가장 양호하였으며, 종래 흑삼구증구포 제조 : 최소 11일 이상 80℃ 저온흑삼 제조 6일 소요, 증숙조건 : 습열, 증숙온도 : 80℃, 증숙횟수: 3회, 건조온도 : 65℃, 종래 흑삼 제조수율 : 25.4% 저온 개선 흑삼제조 수율 : 27.6%, 종래 흑삼 건조엑스함량 : 26.1% 저온개선 흑삼제조 수율 : 31.0%로 흑삼제조시간 단축 및 수율 증대 효과를 얻었다.
② 흑삼의 표준 Ginsenoside 최적분석 조건 확립
HPLC를 이용한 흑삼의 유효 표준 Ginsenoside 지표물질 설정 및 지표물질 성분 분석법을 확립하여 표준화된 검사방법으로 제조 흑삼의 품질을 향상 시킬 수 있었다. 식약처의 인삼사포닌 Rg1 + Rb1 + Rg3 품질규격 및 흑삼의 특이 사포닌 Rg3 + Rg2 함량도 양호하였다.
■ 종래 흑삼제조 (Rg1+Rb1) : 0.53 mg/g 저온개선 흑삼제조 2.46 mg/g
■ 저온 제조 기준치 설정 : (Rg3+Rg2): 0.6 mg/g (실제분석치: 0.93mg/g)
■ 말톨(maltol) 함량기준치 : 0.25% 이상
③ 흑삼의 콜레스테롤 저하 기능에 대한 in vitro 효능 평가
■ 홍삼엑스, 현행흑삼엑스와 저온흑삼엑스의 NO and MTT assay :
RAW264.7과 BV2 cell에서 LPS에 의해 유도된 NO 생성을 홍삼엑스, 현행흑삼엑스와 저온흑삼엑스가 억제할 수 있는지 알아보기 위해 NO assay를 진행하였다. RAW264.7과 BV2 cell 모두에서 농도 의존적으로 (125, 250, 500 and 1000㎍/㎖) NO의 생성을 억제하였다. 또한 홍삼엑스, 현행흑삼엑스와 저온흑삼엑스의 NO 생성 억제능은 RAW264.7보다 BV2 cell에서 조금 더 강한 것을 확인하였다. MTT asay결과 RAW264.7과 BV2 모두 1000㎍/㎖의 농도까지 독성을 보이지 않았기 때문에 NO 생성의 억제는 독성과는 무관한 것으로 확인되었다.
■ 홍삼엑스, 현행흑삼엑스와 저온흑삼엑스의 RT-PCR
BV2 cell에서 홍삼엑스, 현행흑삼엑스와 저온흑삼엑스의 iNOS, COX2와 proinflammatory cytokine의 발현 억제 양상을 확인하기 위하여 BV2 cell에 샘플처리 후 LPS를 이용하여 염증반응을 유발 시킨 뒤 PCR을 실시함. 총 5가지 인자 (iNOS, COX-2, IL-6, IL-1β and TNF-α)의 발현정도를 확인하였다. 그 결과 홍삼엑스는 NO assay의 데이터와 비슷하게 최고농도인 1000㎍/㎖에서 50%이상의 발현 억제능을 보였고, IL-1β 또한 농도의존적으로 많은 양의 cytokine 생성을 홍삼엑스가 억제함. COX-2는 20%정도의 억제를 보였고 나머지 IL-6와 TNF-α의 발현은 전혀 억제하지 못함. 현행흑삼엑스는 iNOS, TNF-α와 IL-1β에서 농도의존적으로 발현이 억제되었고, COX-2는 농도의존적인 양상을 보이진 않았지만 최고농도인 1000㎍/㎖에서 50% 정도의 억제능을 보인 반면 IL-6에서는 아무런 효과를 보이지 않음. 저온흑삼엑스는 NO assay에서 3가지 샘플 중 가장 적은 NO 생성 억제능을 보인것과 유사하게 iNOS의 발현을 눈에 띄게 감소시키지는 못함. 하지만 다른 두 샘플과는 다르게 COX-2의 발현을 농도 의존적으로 많은 양 감소시켰으며 IL-1β 또한 농도 의존적으로 감소하는 그래프를 나타냄. IL-6와 TNFα는 저온흑삼엑스의 처리에 어떠한 효과를 보이지 않았다.
■ 홍삼엑스, 현행흑삼엑스와 저온흑삼엑스의 Prostaglandin E2 assay
Prostaglandin E2 assay를 통해 홍삼엑스, 현행흑삼엑스와 저온흑삼엑스의 PGE2 분비 억제능을 확인함. 3가지 추출물 중 저온흑삼엑스가 농도의존적으로 가장 많은 양의 PGE2 분비를 억제함. 현행흑삼은 500㎍/㎖까지 많은 양의 PGE2의 분비를 억제하였지만 최고농도인 1000㎍/㎖에서는 다시 PGE2의 분비를 증가시킴. 반면 홍삼엑스는 RT-PCR의 COX-2 결과와 유사하게 PGE2 분비에 있어 강한 효과를 보이지 않았다.
■ 홍삼엑스, 현행흑삼엑스와 저온흑삼엑스의 NF-κB luciferase assay
LPS만 단독으로 처리한 세포에서는 NF-κB activity가 증가하였지만 홍삼엑스, 현행흑삼엑스와 저온흑삼엑스를 처리함에 따라 농도의존적으로 NF-kB의 activity가 감소하는 것을 확인하였다.
■ 홍삼엑스, 현행흑삼엑스와 저온흑삼엑스의 western blotting
홍삼엑스, 현행흑삼엑스와 저온흑삼엑스의 MAPKs phosphorylation 억제정도를 알아보기 위해 time course로써 15분, 30분, 60분에 단백질을 추출하여 실험을 진행함. 세가지 샘플이 각기 다른 시간에 phosphorylation을 억제하는 것으로 확인되었다. 홍삼엑스에서 p-ERK는 15분, p-JNK는 30분 그리고 p-p38은 15분에 약하게 phosphorylation이 억제됨. 저온흑삼엑스의 경우 p-ERK는 15분, 30분에서 강하게 phosphorylation을 억제하였지만 p-JNK와 p-p38는 효과가 없었음. 현행흑삼엑스는 p-ERK 30분에 phosphorylation이 억제되었고, p-JNK와 p-p38는 15분에서 약한 억제능을 보였다.
④ 흑삼의 콜레스테롤 저하 기능에 대한 in vivo 효능 평가
■ 백삼엑스, 홍삼엑스, 저온흑삼엑스와 현행흑삼엑스의 지질성분변화
총 콜레스테롤 (total cholesterol, T-CHOL)은 high cholesterol diet 식이군 (HCD)에서 Normal diet 식이군(ND)보다 상승하였으나 각각의 샘플에서는 효과가 없었다. 중성지방 (Triglyceride, TG)은 HCD군에서 오히려 ND군보다 수치가 감소하였고, 모든 샘플에서 효과가 없었다. 고밀도지단백 (High-density lipoprotein, HDL)은 샘플을 투여한 군에서 HCD군 보다 조금 수치가 상승하는 것을 확인하였다. 저밀도지단백 (Low-density lipoprotein, LDL)은 HCD군에서 ND군보다 2배이상 수치가 증가하였으며, 백삼과 저온 흑삼을 투여한 마우스에서 수치가 일정량 감소하는 것을 확인하였다.
■ 백삼엑스, 홍삼엑스, 저온흑삼엑스와 현행흑삼엑스의 GOT, GPT변화
ND보다 HCD에서 glutamic oxaloacetic transaminase (GOT or AST)와 glutamic-pyruvic transaminase (GPT, ALT)의 수치가 증가한 것을 확인하였다, GOT 수치는 저온흑삼과 현행흑삼이, GPT수치는 백삼엑스와 저온흑삼엑스가 약한 효과를 가지고 있는 것으로 확인되었다.
⑤ 흑삼의 고콜레스테롤혈증 동물모델에서의 효능 평가
본 연구는 흑삼의 새로운 제조 공정 방법을 통하여 제조된 흑삼의 저온제조 흑삼의 에탄올 추출물(BG_EoTH) 과 저온제조 물추출물(BG_H2O)이 고콜레스테롤 사료(D12336)로 유도된 고콜레스테롤혈증 생쥐 모델에서 콜레스테롤개선 효능을 입증하고자 하였다.
■ 체중변화는 실험종료 13주 최종기준으로 대조군에 비하여 양성대조군 Lovastatin, 그리고 실험군에서는 고콜레스테롤혈증 대조군 (D12336-NC)에 비하여 BG_EoTH (200 mg/kg)에서는 11.6g과 BG_H2O (200 mg/kg)에서는 11.0g 감소된 추이를 보여서 체중변화와는 큰 차이를 나타내지 않았다.
■ 고콜레스테롤혈증 대조군 (D12336-NC)의 식이효율이 23.62%임을 나타내고 있으며, 이에 비하여 식이효율은 고콜레스테롤혈증 대조군 (D12336-NC)에 비하여 양성 대조군인 Lovastatin 투여군, BG_EoTH (200 mg/kg), 그리고 BG_H2O (200 mg/kg)등 실험그룹에서 감소된 추이를 보였으나 통계학적 유의성은 나타나지 않았다.
■ 고콜레스테롤혈증 병태모델에서 시험물질에 따른 혈청내 총콜레스테롤(total cholesterol)의 수준을 나타내는 그래프로, 고콜레스테롤혈증 대조군 (D12336-control)의 혈청내 총콜레스테롤(total cholesterol) 수준은 정상대조군의 혈청내 총콜레스테롤(total cholesterol)에 비하여 약 5.4%이상 증가를 나타내었다. 실험군에서는 BG_H2O (200 mg/kg)(p<0.05)과 BG_EoTH (200 mg/kg)(p<0.05)등이 대조군에 비하여 33.9%와 30.4% 이상 통계학적 유의성 있게 감소를 나타냈다.
■ 고콜레스테롤혈증 병태모델에서 시험물질에 따른 혈청내 저밀도 콜레스테롤 (LDL-cholesterol)의 수준을 나타내는 그래프로, 고콜레스테롤혈증 대조군 (D12336-control)의 혈청내 저밀도 콜레스테롤 (LDL-cholesterol) 수준은 정상대조군의 혈청내 저밀도 콜레스테롤 (LDL-cholesterol)에 비하여 약 13.3%이상 증가를 나타내었다. 실험군에서는 BG_H2O (200 mg/kg)(p<0.05)과 EoTH (200 mg/kg)(p<0.05)등이 고콜레스테롤혈증 대조군에 비하여 35.2%와 33.8% 이상 통계학적 유의성 있게 감소를 나타냈다 (Fig. 5,Table 3). 그러나 양성대조군인 Lovastatin 투여군은 고콜레스테롤혈증 대조군 (D12336-control)에 비하여 혈청내 저밀도 콜레스테롤 (LDL-cholesterol) 수준이 감소는 하였으나 통계학적 유의성은 나타나지 않았다.
■ 고콜레스테롤혈증 대조군 (D12336-control)의 간무게 (liver weight)은 정상대조군의 간무게 (liver weight)에 비하여 46.7% 이상 증가를 하였다. 그리고 고콜레스테롤 혈증 대조군 (D12336-control)에 비하여 양성대조군인 Lovastatin 투여군은 차이가 없었고, BG_H2O (200 mg/kg)과 BG_EoTH (200 mg/kg)은 고콜레스테롤혈증 대조군 (D12336-control)에 비하여 감소하였으나 통계학적으로 유의성 있게 감소한 투여군은 BG_EoTH (200 mg/kg) (p<0.001)으로 나타났다.
■ 간조직에서 발현되는 ACAT2, HMG-CoAR, SREBP2 mRNA 유전자 발현은 고콜레스테롤혈증 대조군 (D12336-control)에 비하여 Lovastatin와 BG_H2O (200 mg/kg) , 그리고 BG_EoTH (200 mg/kg) 투여군은 통계학적 유의성 있게 감소를 나타내었다.
■ 조직검사에서도 양성대조군 Lovastatin 200 mg/kg (D12336-Lovastatin_20) 투여군, BG_EoTH 과 BG_EoTH 투여군이 지방세포 크기 증가, 지방 축적 (oil red O 염색)을 억제하였고, 간조직에서는 양성대조군 Lovastatin 200 mg/kg (D12336-Lovastatin_20) 투여군, BG_EoTH과 BG_EoTH 투여군이 대조군에 비하여 지방구 및 지방 침착을 억제하는 결과를 나타내었다.
✌ 결론적으로 고콜레스테롤 사료(D12336)(D12336) 급여 고콜레스테롤혈증모델에서 콜레스테롤개선 BG_EoTH & BG_H2O 추출물을 6주간 투여로 지방조직 중량 감소, 혈중 총콜레스테롤 수준 감소, 혈중 저밀도콜레스테롤수준 감소, ACAT2, HMG-CoAR, SREBP2 mRNA 유전자 발현량 감소등으로 콜레스테롤개선 효과를 나타내고, 간과 지방세포에서 생체 에너지 대사 조절하는 ACAT2, HMG-CoAR, SREBP2 mRNA 유전자 발현이 억제되어 간에서 콜레스테롤의 합성을 억제하는 기전으로 콜레스테롤개선 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
⑥ 저온제조 흑삼을 이용한 콜레스테롤 저하 헬스케어 제품 개발
저온제조 흑삼을 이용한 콜레스테롤 저하 헬스케어 제품으로 파우치, 절편, 엑기스, 드링크 제품 등 다양한 제형별로 제품의 다각화를 실현하여 상품화하였다.
⑦ 저온제조 흑삼을 이용한 콜레스테롤 저하 헬스케어 제품을 위한 상표출원
본 연구 결과를 바탕으로 저온제조 흑삼을 이용한 콜레스테롤 저하 개선효과를 부각시킨 제품 생산을 위한 상표를 출원하였다(위아체 흑삼 Weache Black Ginseng).
This study was conducted to develop a new method for enhancing ginsenoside Rg1, Rb1, Rg3, which is abundant in black ginseng (BG) and to evaluate low-cholesterol effect of processed BG using high cholesterol animals model.
BG was prepared according to the trad
This study was conducted to develop a new method for enhancing ginsenoside Rg1, Rb1, Rg3, which is abundant in black ginseng (BG) and to evaluate low-cholesterol effect of processed BG using high cholesterol animals model.
BG was prepared according to the traditional manufacfuring method: “九蒸九曝”. Ginsenoside Rg3 was not detected in white ginseng and its content in WG, 6.44 mg/g, was about 53.7, 11.9, 5.0 times higher than that in 2-, 3-, 6-time repeatedly steamed ginsengs, respectively.
However, the current method for preparing BG has several disadvantages such as long-term consuming production, limit to mass production, etc, which lead to the high price and poor acceptance. In order to make BG more popular and more accessible, several variables including steaming temperature, time, steaming number, etc. that affect the quality of BG were investigated. As a result, a process was developed for preparing a novel BG (6.56 mg/g). Moreover, the PAHs contamination was not detected by GC-MS in the finished BG products.
The traditional method of manufacturing black ginseng uses “九蒸九曝”. It has many disadvantages for not only taking a long time, but also producing carcinogen as a result of making carbonated ginseng by faulty streaming process. However, in this study, we have developed a new method of manufacturing black ginseng that has reduced manufacturing time one the basis of physical and chemical convertible method and increased the production of specific ginsenoside. The traditional method of manufacturing black ginseng uses “九蒸九曝”. that involves ginseng undergoing nine times of streaming and drying. This process takes up almost 18 days and the yield of black ginseng is almost 25.4%. The low yield is due to the production of soluble unknown byproducts that has elucidated during the process. In addition to this, the final product of black ginseng has a strong taste of sourness, bitterness and soupiness. The improvements for the following limitations of the traditional manufacturing method have been demanded in the past. For the improvement of these limitations, we have repeated the streaming of ginseng, within the range of 60 ~ 98℃, and discovered that 80℃ is the optimum temperature for the best output of black ginseng. The developed manufacturing method of black ginseng: takes at lest 11 days à 80℃ low black ginseng manufacturing method 6 days required, streaming condition: streaming temperature: 80℃, repeats of streaming : 3 times, drying temperature: 65℃, traditional black ginseng yield: 25.4% → new manufacturing method 27.6%, traditional black ginseng dried unknown byproducts: 26.1%→new manufacturing method: 31.0%. As demonstrated by the following, we have not only reduced manufacturing time but also have increased the final quality and yield of the black ginseng as a result of this study.
Hypercholesterolemia is a serious problem that is being faced by many countries and is nowadays a major cause of biggest concern for health professionals, since it constitutes for one of the prime risk factors for the development and growth of cardiovascular diseases, like atherosclerosis and its complications, acute infarction of the myocardium or hypertension, accumulation of low density lipoproteins, stroke and cerebral infarctions. Moreover, there is a substantial correlation between these diseases and lipid abnormalities, especially high level of plasma cholesterol, and blood pressure. The continuous ingestion of high amounts of fat seems to be directly related to hypercholesterolemia in human population. Diet related chronic diseases like type 2 diabetes, cardiovascular diseases, several types of cancer and increased morbidity and mortality can be attributed to obesity and overweight. Generally it is a fact that obesity occurs due to an imbalance between energy intake and energy output. An imbalance in this ratio results in accumulation of fat inside adipose tissues and elevated Low density lipoproteins inside blood and other fat accumulation organs. There are many drugs in market available for fat accumulation related anomalies but they pose serious side effects like renal failure and gastrointestinal abnormalities. So, nowadays more attention is being paid on the natural products for alleviation of these chronic diseases as natural products are efficacious in treatment of chronic with minimum or no side effects.
Ginseng and ginsenosides have been researched since long time for its therapeutic effects on body vitality, immune system, various types of cancer, inflammatory anomalies, and nervous system disorders, reproductive system functioning and cardiovascular diseases. In addition, there are many studies that reveal the ginseng’s beneficial effects on hypercholesterolemia and reduction of total cholesterol levels. Studies in past have shown ginseng’s potent suppressing effects on in vitro pancreatic lipase activity and reduced obesity and plasma lipid profile in presence of high fat diet fed to rodents. Ginseng prime activity is actually due to the ginsenosides present in it. Uptill now there are a number of ginsenosides being discovered and explored for their marvelous therapeutic activities. Basically in a broader scenario, ginseng is divided in three types, the Red ginseng, White ginseng and Black ginseng. Here our interest is in Black ginseng. Black ginseng is prepared from raw ginseng by steaming it for nine times at a high temperature for around 3 hr till the pint it becomes black. At this point the black ginseng possesses better qualities than red ginseng like anti-inflammatory, anti-metastatic and anti-oxidant. This pharmacologically active agent has been studied for many aspects before but its effects in hypercholesterolemia have not been studied in detail as yet. Here in our research, we report for the first time the amelioration of hypercholesterolemia in high cholesterol fed rats. Our results showed that black ginseng water and ethanol extract, effectively lowered the total serum levels of cholesterol. It also increased the food efficiency ratio and the differential WBC count was also elevated by black ginseng extract. The key gene markers for fat metabolism like ACAT2, HMG CoA r and SERBP 2 were also reduced by black ginseng extract at mRNA levels. Moreover the histopathological images also show reduction in fat accumulation in liver and adipose tissues. So in a nutshell black ginseng appears to be a promising anti-hypercholesterolemic agent.
Cholesterol is a lipid that is being produced by liver and is important for various bodily functions. Besides the bad image for cholesterol, it is important component for various enzymes, sex hormones, bile juices and outer membranes of cells. Within the safe limit cholesterol, is mandatory for proper homeostasis of living body. However any excess of cholesterol that is not being used by the body is deleterious for it because with the passage of time it accumulates as bad cholesterol or so called “Low Density Lipoproteins” (LDL).
Due to the increasing trend of unhealthy foods which mainly includes fast foods, inadequate daily routines including lack of exercise and un healthy work environment and other competitive stresses, the risk for accumulation of excessive cholesterol inside body and cardiovascular diseases is a serious concern for health professional all over the world in this 21stcentury. Chemical drugs are a solution to these CVD anomalies however the irreversible damaging effects gifted by these drugs are inevitable.
Natural products like herbs, leaves and roots of some plants are being tested worldwide for their efficacy in serious pathological conditions like various types of cancers and cardiovascular diseases. Ginseng has long been used for treatment of heart failure and to protect tissue damage under cellular and environmental stress with manifestation of any side effects. So in nutshell, there is numerous research on the cardioprotective effects of ginseng on cardiovascular system but the effect of black ginseng on hypercholesterolemia remains limited.
In our study herein we found that black ginseng water and ethanol extract both decreased the total cholesterol and LDL- cholesterol levels of serum. However the HDL-cholesterol and triglyceride levels of serum remain unaffected. It indicates that black ginseng extract can efficaciously diminiuated the levels of above mentioned “Bad Cholesterol” inside rat model of hypercholesterolemia.
In conclusion, the administration of black ginseng extract in SD rats with high cholesterol diet lowered the LDL cholesterol levels, caused an elevation in the serum triglyceride levels and increased the food efficiency. Moreover, with respect to the liver metabolic marker genes, the mRNA expression of ACAT2, HMG-CoAr and SERBP2 were inhibited by black ginseng ethanol and water extract. The histological changes brought by high cholesterol diet in liver and adipose tissues were reverted by black ginseng extracts as can be seen from H&E and Oil Red O staining. With this first report on hypercholesterolemic effect of black ginseng water and ethanol extract in rats, we can conclude that these extracts can be studied in future as functional food for various cardiovascular related anomalies. Therefore, these results suggest that black ginseng extract are promising candidates applicable to the development of cholesterol-lowering nutraceutical food and drugs.
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