보고서 정보
주관연구기관 |
경기대학교 Kyonggi University |
연구책임자 |
신광순
|
참여연구자 |
허병석
,
이대희
,
박정희
,
김경옥
,
조동운
,
전종은
,
김선진
,
엄햇님
,
백은종
,
김주희
,
도경민
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2014-08 |
주관부처 |
농림수산식품부 Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries |
과제관리전문기관 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs |
등록번호 |
TRKO201800001527 |
DB 구축일자 |
2018-12-15
|
초록
▼
1. 연구개발 목표 및 내용
가. 연구개발 목표
ㅇ 전통발효식초의 간 보호 효과 및 장관면역 기능성에 대한 과학적 평가 및 핵심 물질 구명
나. 연구개발 내용
ㅇ 전통발효식초의 공시시료 선정
ㅇ 전통발효식초의 기능성 성분 분획법 수립
ㅇ 전통발효식초의 간 보호 효과 평가 및 메카니즘 규명
ㅇ 전통발효식초의 장관면역 기능성 평가 및 메카니즘 규명
2. 연구결과
가. 전통발효식초의 공시시료 선정
(1) 전통발효식초의 이화학적 특성
ㅇ 공시시료 선정을 위해 시중에 판매되는
1. 연구개발 목표 및 내용
가. 연구개발 목표
ㅇ 전통발효식초의 간 보호 효과 및 장관면역 기능성에 대한 과학적 평가 및 핵심 물질 구명
나. 연구개발 내용
ㅇ 전통발효식초의 공시시료 선정
ㅇ 전통발효식초의 기능성 성분 분획법 수립
ㅇ 전통발효식초의 간 보호 효과 평가 및 메카니즘 규명
ㅇ 전통발효식초의 장관면역 기능성 평가 및 메카니즘 규명
2. 연구결과
가. 전통발효식초의 공시시료 선정
(1) 전통발효식초의 이화학적 특성
ㅇ 공시시료 선정을 위해 시중에 판매되는 식초를 대상으로 주정초가 아니며 원료를 100% 포함하는 국내산 전통발효식초 및 대조군으로 해외산 식초를 수거하였다.
ㅇ 수거한 시판 식초(국내식초 6종, 해외식초 5종)의 이화학적 특성(총 산도, 아세트산, 아세트산 순도, TN, 총 아미노산, 유리아미노산, 총 폴리페놀, Crude polysaccharide)을 비교분석하여 국내산 식초 4종(사과식초, 감식초, 와인식초, 현미식초), 해외산 식초 2종(현미식초, 와인식초)를 1차적으로 선별하였다.
ㅇ 국내산 식초와 해외산 식초의 이화학적 특성 비교 결과, 국내산 식초는 해외산 식초보다 acetic acid의 순도가 약 3~5% 가량 낮았으며, 발효 과정 중 단백질이 아미노산화로 진행된 것을 확인할 수 있었으며, 국내산 식초에서 조다당의 함량이 월등히 높게 나타났다.
(2) 전통발효식초로부터 조다당체의 분리 및 화학적 특성
ㅇ 국내산 전통발효식초 4종 [사과식초(KAV-0) 와인식초(KWV-0), 현미식초(KBV-0), 감식초 (KPV-0)]와 해외산 발효식초 2종[영국와인식초(UWV-0), 일본현미식초(JBV-0)]로부터 다당을 분리하여 다당 시료의 수율, 화학특성 및 면역활성을 비교 검토하였다.
ㅇ 이 결과, 활성 및 수율이 우수한 3개 다당(KBV-O, JBV-0 및 KPV-0)을 선정할 수 있었으며, 이들을 대량 조제하여 제반 화학특성 특성을 규명한 결과 국내 및 일본산 현미식초 유래 다당 (KBV-0 및 JBV-0)은 발효 미생물 유래 mannan을 주성분으로 함유하고 있었으며, 국내산 감식초 유래 다당 (KPV-0)은 원재료인 감에서 유래한 pectin을 주성분으로 함유함이 확인되었다.
나. 전통발효식초의 기능성 성분 분획법 수립
(1) 전통발효식초의 기능성분 분리 및 대량 분리법 확립
ㅇ 전통발효식초 중 국내산 감식초 및 국내산 현미식초에서 기능성 성분의 분리를 위하여 에탄올 침전법을 적용하여 분획을 실시하여 각 샘플별로 3가지의 샘플을 제조하였으며, 국내산 감식초 및 국내산 현미흑초를 각각 25kg를 이용하여 에탄올 침전법으로 대량으로 분리하였다.
ㅇ 증발농축기를 이용하여 수분을 최대한 제거한 후 에탄올을 1:3 비율로 첨가하여 20시간 저온 침전시킨 후 동결건조를 거쳐 대량의 식초 샘플을 제조하여, 일반성분 분석, 지표물질 분석, in vitro, in vivo 실험에 사용하였다.
(2) 전통발효식초의 유효성분 분석
ㅇ 국내산 현미식초 농축액의 조단백질함량은 17%, 국내산 감식초 농축액의 조단백질함량은 2.4% 로써, 7배 이상 국내산 현미식초의 조단백함량이 높은 것으로 조사되었고 분획물에 따른 총 아미노산의 프로파일은 일반성분의 조단백함량과 유사한 경향을 보여주었으며, 국내산 현미식초 농축액이 감식초 농축액보다 9배 이상 많은 총아미노산 함량을 보여주었다.
ㅇ 모든 분획에서 가장 함량이 높은 아미노산은 glutamic acid로 조사되었으며, 국내산 현미식초 및 감식초에 공통적으로 포함된 유기산은 citric acid, acetic aicd, lactic acid, pyroglutamic acid로 조사되었다.
ㅇ 곡류보다 유기산 함량이 높은 감은 유기산 분석에서 보듯이 단백질에서 기인한 아미노산인 glutamic acid의 발효로 생선된 pyroglutamic acid를 제외한 모든 유기산이 감식초 분획물에서 많았다.
ㅇ 식초의 기능성 지표물질인 ferulic acid 분석 결과, 감식초에서는 항산화 물질의 대표적인 fernlic add가 존재하지 않음을 알 수 있었고, 국내산 현미식초에는 유리형의 형태보다는 수용성 식이섬유에 결합된 bound fomi으로 ferulic acid가 존재하는 것으로 (47.5 yg/g)의 함량으로 조사되었다.
ㅇ 또한, UPLC-QTOF-MS를 이용한 식초의 기타 항산화 물질 정성 및 정량 결과, 국내산 감식초에서 발견되는 항산화 성분인 phenolic acid 는 caffeic acid, 4-hydroxybenzoic acid, 3,4~hydroxybenzoic acid 총 3가지가 발견되었으며, 국내산 현미식초의 경우 caffeic acid, 4-hydroxybenzoic acid, 3,4-hydroxybenzoic acid 이외에 sinapic acid, vinillic acid가 추가적으로 발견되어 총 5가지의 phenolic acid가 포함되어 있는 것으로 분석되었다.
다. 전통발효식초의 간 보호 효과 평가 및 메카니즘 규명
(1) 전통발효식초의 간 보호 효과 (in vitro) 평가
ㅇ 생체 내에서 생성되는 활성산소는 인체의 노화와 질병을 유발하는 주요 원인으로서 세포와 조직에 해로운 독성을 일으켜 질병을 유발하는 것으로 알려져 있음. 대표적인 활성산소 유도물질인 ethanol을 처리하여 산화된 간세포에 전통발효식초를 처리함으로써 산화방어기전과 관계된 효소들의 mRNA 발현과 활성을 확인하였음. 국내산 현미식초 및 국내산 감식초는 ethanol로 인해 감소한 superoxide dismutase(SOD)의 활성을 유의적으로 증가시킴으로써 항산화 활성을 증가시켰으며, 각각의 분획물들에서도 같은 결과를 얻었다.
(2) 전통발효식초의 간 보호 효과 (in vivo) 평가
ㅇ 수컷 Wistar Rat에 16일간 강제 경구투여로 50%(v/v) 에탄올올 제공하여 간 손상을 유도하였으며, 동시에 전통발효식초를 경구투여 하여, 알코올성 간 손상에 대한 전통발효식초의 효능을 확인하였다.
ㅇ 간 손상 지표인 serum AST, ALT 수준이 에탄올 대조군에 비해 국내산 현미식초, 국내산 감식초 및 일본산 현미식초군에서 감소하는 경향을 보였는데, 국내산 감식초 군에서의 감소폭이 가장 컸으며, 간 조직 알코올 대사 관련하여 간 조직 cytosol 분획에서의 ADH 활성은 에탄올 대조군에 비해 국내산 현미식초, 국내산 감식초 및 일본산 현미식초군에서 그 수준이 증가하는 경향을 보였다.
ㅇ 간 조직 mitochondria 분획에서의 ALDH활성은 에탄올 대조군에 비해 국내산 현미식초군과 국내산 감식초 군에서 그 수준이 증가하는 경향을 보였으며, 일본산 현미식초군의 수준은 에탄을 대조군의 활성과 차이를 보이지 않았다.
ㅇ 간 조직 및 적혈구 항산화 대사와 관련하여 간 SOD 활성은 에탄올 대조군에 비해 국내산 감식초군의 그 수준이 유의적으로 증가하였으나, 에탄올 대조군에 비해 국내산 현미식초와 일본산 현미식초군의 활성의 차이는 보이지 않았다.
ㅇ 적혈구 CAT 활성은 에탄올 대조군에 비해 국내산 현미식초, 국내산 감식초 군의 활성은 감소하는 경향을 보였고, Plasma MDA는 에탄올 대조군에 비해 국내산 감식초, 일본산 현미식초군에서 수준이 감소하는 경향을 보였다.
ㅇ 한편, 감식초 농축액 (PT) 및 감식초를 에탄올 침전법으로 분획한 에탄올 불용성 분획물 (PI)및 에탄올 가용성 분획물(PS)의 알코올 스트레스에 대한 간 내 항염증 및 알코을 대사에 대한 효능을 알코올을 4주간 1일 1회 경구 투여한 동물 모델을 통해 규명하였다.
ㅇ 간 조직의 형태학적 분석에서 에탄올 대조군 (ET)과 비교하여 감식초 농축액 및 에탄올 불/가용성 분획물 투여군에서 간 조직 내 지방의 크기가 작고 분포가 적은 것으로 확인되었고, 간 조직에서 알코올 스트레스에 대한 염증 대사 발현 인자를 확인하고자 qPCR을 이용하여 TNF-a, IL-6, IL-1P, IL-12P, TLR 4, CD14, MCP-1, MIP-2, C0X-2의 발현 정도를 측정한 결과 염증성 사이토카인인 IL-1P에서 PI 및 PS군에서 ET군과 비교하여 그 발현이 유의적으로 감소하였으며, IL-12P에서 모든 감식초 투여군에서 ET군에 비해 그 발현이 유의적으로 감소하였다.
ㅇ COX-2의 발현 역시 모든 감식초 투여군에서 ET군에 비해 그 발현이 현저하게 감소하였으며, 에탄올에 의한 LPS 자극으로 유도되는 TLR4 수용체의 발현 역시 ET군에 비하여 PI 및 PS군에서 유의적인 감소를 보였다.
ㅇ 간 내 에탄을 대사과정의 주요 효소인 CYP2E1 의 단백질 발현을 측정한 결과, ET군이 NC군에 비해 발현이 유의적으로 증가하였고, PT군의 발현이 미와 PS를 투여한 군에 비하여 CYP2E1 의 발현이 유의적으로 감소됨을 확인하였다.
ㅇ 결론적으로 4주간의 에탄올 경구투여는 알코올 대사 효소의 발현 증가와 간 내 염증성 사이토카인 및 염증 인자의 생성을 촉진하였으며, 이에 대해 감식초 농축액 및 그 분획물의 투여가 에탄올 섭취로 유도되는 LPS/ TLR4 신호 매게 전달 경로와 관련된 염증성 사이토카인 및 관련 인자를 조절함으로써 면역 기전 조절의 가능성이 있을 것으로 사료되었으며, 더욱이 감식초 농축액 (PT)의 투여는 에탄올 대사과정에 있어 주요 효소로 작용하는 CYP2E1 의 단백질 발현을 억 제하였으므로 알코올 대사 효율에 있어 감식초의 가능성을 확인할 수 있었다.
라. 전통발효식초의 장관면역 기능성 평가 및 메카니즘 규명
(1) 전통 현미발효식초 유래 다당의 전신면역계 활성 (in vitro) 평가
ㅇ 전통발효 식초를 이용하여 새로운 장관면역활성 증진 소재를 개발하기 위해,6종의 국내·외 유래 전통발효 식초로부터 조다당을 분리하였으며, 이들의 화학적특성과 면역 증진활성을 평가는 데, 국내산 전통 현미발효 식초, 일본산 전통 현미발효 식초 및 국내산 발효 감식초를 이용하여 조제된 3 종류의 조다당 (KBV-0, JBV-0 및 KPV-0)이 다른 전통발효 식초들보다도 우수한 수율과 마크로파지에서 유래한 사이토카인 생성능을 확인하였다.
ㅇ KBV-0 및 JBV-0는 Man와 Glc툴 주요 구성당으로 함유하였으나, 그 함량은 서로 유사하지 않으며, KPV-0 KBV-0 및 JBV-0에 비해서 높은 서와 Rha의 함량과 함께 Man와 Glc를 함유하고 있었다.
ㅇ KBV-0, KPV-0 및 JBV-0의 다양한 면역증진 활성을 검색했는데, KBV-0와 KPV-0는 JBV-0에 비해 우수한 항보체 활성을 나타내었다.
ㅇ KPV-0는 Balb/c 마우스에서 유래한 복강 마크로파지뿐만 아니라 마우스 유래 마크로파지 세포주인 RAW 264.7 세포의 NO, IL-6 및 IL-12의 생성을 유의적으로 증가시으며, Peyer’s patch 세포를 경유한 골수세포 증식능뿐만 아니라 IgA와 TGF-P의 생성능의 유의적인 증가를 보여주었다.
(2) 전통 발효식초 유래 다당의 장관면역계 활성 (in vitro) 평가
ㅇ 면역활성이 우수한 전통 현미발효 식초 (KBV-0)와 감식초 (KPV-0)에서 유래한 다당체는 면역활성을 나타내는 성분을 동정하고 확인하기 위하여 각각 Sephadex G-75 겔여과 크로마토그래피를 이용하여 분획되었는데, KBV-0로부터 3개의 정제획분 (KBV-I, II 및 III)과 KPV-0로부터 3개의 정제획분 (KPV-I, 0 및 III)으로 각각 분획되었다.
ㅇ 가장 고분자 획분인 KBV-I은 60 kDa로,주로 Man (58.4%)4 함께 소량의 Gal (12.1%)와 Glc (13.3%)를 포함하는 중성당 (96.9%) 획분으로 분석되었으며, KPV-I도 60 kDa으로, 주로 Ara (58.4%), Man (19.6%) 및 Gal (15.2%)의 중성당과 함께 uronic acid (14.6%)를 포함하는 것으로 분석되었다.
ㅇ KKVM과 KFV-I은 모두 β-glycosyl Yariv 시 약과 반응했기 에 이들은 모두 arabino-β-3,6-galactan 영역의 존재를 제시하는 결과로 나타났다.
ㅇ 모든 정제 획분들은 모두 Balb/c 마우스로부터 유래한 복강 마크로파지와 마우스 유래 마크로파지 세포주인 RAW 264.7 세포, 그리고 인간의 장 상피세포주인 Caco-2 세포주에 대한 독성은 나타내지 않았고, KPV-I은 Balb/c에서 유래한 복강 마크로파지로부터 m-6, IL-12, TNF-a 및 NO의 생성능이 다른 획분들에 비해 유의적으로 높게 나타났다.
(3) 전통 발효식초 유래 장관면역 활성 정제다당의 지표성분 설정 및 활성구조 동정
ㅇ KBV-I은 메틸화 분석을 통해 25개의 서로 다른 글리코시드 결합으로 구성되었는데, 주로 효모세포벽 구성성분인 mannan (약 60%) 유래와 현미의 발효과정에서 유리되는 pectin의 RG-I (약 30%)으로 사료되었다.
ㅇ KPV-I은 21개의 서로 다른 글리코시드 결합으로 구성되며 70%의 RG-I의 결합양식으로 밝혀졌고, terminal-, 2-결합 및 2,4-Man의 존재는 효모 세포벽에서 유래된 만난 (20%)으로 예상되었다. 이러한 결과로, 국내 감식초 유래 다당(KPV-0)은 면역자극 활성을 증진시킬 수 있는 것과 함께 RG-I (KPV-I)이 활성에 관여하는 주요한 성분으로 나타났다.
ㅇ 구성당 분석 결과 KBV-0는 건조물에 대해 62.9%의 총당을 포함하며 주로 glucose와 mannose (36.6과 13.7%)와 함께 galactose, xylose 및 arabinose (5.2, 3.8 및 2.9%)로 구성되는 것으로 나타났으며, KPV-0는 KBV-0와 총당 함량에서는 KBV-0와 유사했지만 (건조물의 61.5%), 구성당은 mannose, arabinose, galactose, glucose, xylose 및 rhamnose (각각 15.6, 12.5, 10.4, 9.9, 6.3 및 6.2%)로 다른 조성을 나타났다.
ㅇ 이러한 결과로 본 연구진은 장관면역 증진을 위한 기능성소재로 활용하기 위해 KBV-0는 10% 이상의 mannose를, 그리고 KPV-0는 9% 이상의 arabinose와 8% 이상의 galactose를 포함해야 한다고 제시하고자 한다.
(4) 전통 발효식초 유래 다당의 장관면역 활성 (in vivo) 평가
ㅇ 전통발효 식초에서 분리된 다당의 장관면역계 증진활성을 in vivo 효과로 검토하기 위하여, KBV-0와 KPV-0는 각각 C3H/HeN 마우스에 각각 4개의 실험군 (0, 50, 500 and 5,000 U g/mouse, 20일) 나누어 경구투여 되었다.
ㅇ 이 결과에서, KPV-0를 투여한 군에서는 Peyer’s patch 세포, 장관 내액 및 분변에서 IgA 생산을 유의적으로 증진시켰을 뿐 아니라, Peyer’s patch에서 다양한 사이토카인 (IL-6, GM-CSF 및 TGF-β)의 생산을 농도의존적인 경향으로 증가시켰다.
ㅇ 이러한 모든 연구를 통해 국내 전통발효 식초인 현미발효 식초 및 감식초로부터 유래한 다당은 장관면역 활성 증진에 도움이 될 수 있는 기능성식품 또는 의약소재로의 활용이 가능하며, 이를 통하여 본 사업의 최종 목표였던 한식의 세계화에도 크게 이바지 할 수 있을 것으로 사료된다.
(5) 전통 발효식초의 장관면역계 효능 (면역관용) 평가
ㅇ 전통 발효식초의 장관면역계의 면역관용을 평가하기 위해 수컷 C57BL/J (6주령)를 23일간 매일 감식초 농축액 (PV) 및 현미식초 농축액 (UV)를 각 200 mg/kg B.W 혹은 400 mg/kg B.W를 경구투여하여 시험 시작 후 2주 뒤부터 9일간 DSS를 식수에 혼합한 동물 모델을 통해 규명하고자 하였다.
ㅇ 9일 간의 DSS 섭취 기간 동안 DAI 측정 결과 DSS군에 비하여 감식초 농축앵 저용량군(DPL)에 서 감소하는 경향을 보였으며, colon 조직의 형태학적 분석에서 pathological score가 DSS군과 비교하여 감식초 농축액 고용량군 (DPH)에서 DSS군에 비하여 유의적으로 감소하였으며, 염증, 세포사 및 재생에서도 유의적인 효과를 관찰할 수 있었다.
ㅇ 이에 따라 Quantitative real-time-transcription polymerase chain reaction을 이용하여 염증 대사 발현 인자를 확인하고자 TNF-a, IL-6, 및 IL-1P의 발현 정도를 측정하고, IkB 및 NFkB를 측정 하였으며, 세포 증식 및 세포사에 대한 효과를 확인하고자 기전 인자인 b-catenin, c-myc 및 cyclin d 그리고 caspase-3 및 caspase-9의 발현 정도를 측정하였는데, 뮤신 분비를 관여하는 MUC2의 발현 정도를 측정한 결과 TNF-a에서 DSS군이 증가하는 경향을 보였으며, DSS군과 비교하여 DPL군이 감소하는 경향을 나타내었다.
ㅇ 결론적으로, 9일 간의 4% DSS는 colon에 세포사 및 염증 인자의 생성을 촉진시키고 이로 인해 정상 대조군에 비하여 몸무게 및 장기 무게의 유의적인 차이를 보임을 확인하였으며, 이에 대해 감식초 농축액이 염증 사이토카인 유전자 발현을 약화시키며, 세포 증식의 조절 인자의 발현 조절 가능성이 있을 것으로 사료되었다.
3. 연구성과 및 성과활용 계획
가. 학술발표 4건
ㅇ 2013년 한식세계화 심포지엄(2013.05.15., 경기대 신광순 교수)
- 전통발효식초 기능성 규명 연구
ㅇ 2013년 한국영양학회 추계학술대회 및 제48회 정기총회 (13.11.08., 이화여대 이혜민)
- Persimmon vinegar extract protects alcohol-induced hepatic inflammatory damage in Wistar rats
ㅇ 2013 International Symposium and Annual Meeting of the KFN (13.11.14., 경기대)
- Intestinal immune system modulating activities of polysaccharides from Korean traditional vinegars manufactured with different raw materials
ㅇ 2013 Annual Meeting of Korean Society of Food Science and Technology (13.08.29., 경기대)
- Characteristics and iirmuno-stimulating activities of P/S from Korean Traditional Vinegars
나. 홍보, 전시회 참여 2건
ㅇ 2012년도 생명산업과학기술대전 (12.09.20. 22., 샘표식품(주))
ㅇ 2013년도 생명산업과학기술대전 (13.09.26. 28., 샘표식품(주))
다. 논문투고 및 특허출원
ㅇ Chemical characteristics and immiino-stimiilating activity of the polysaccharides from fermented vinegars manufactured with different raw materials (한국식품영양과학회 투고완료, 2014년 43권)
ㅇ Characterization of RAW 264.7 cells stimulating polysaccharides from brown rice and persimmon vinegars (2014년 9월중으로 한국식품영양학회지 투고 예정)
ㅇ Effect of oral administration of polysaccharide isolated from Korean black vinegar on intestinal immune system (2014년 9월중으로 Food Chemistry 투고 예정)
ㅇ Structural characterization of immuno-stimulating polysaccharide purified from Korean persimmon vinegar (작성 중, 2014년 10월중으로 투고예정)
ㅇ Modulatory effects of persimmon vinegar and its fractions on etiianol-induced hepatic inflammatory stress and CYP2E1 expressions in rats (투고예정, 작성 중)
(출처 : 연구개발보고서 초록 21P)
Abstract
▼
1. Selection of physiologicaly active sample from traditional fermented vinegars
▪ Physicochemical properties of traditional fermented vinegars
In order to select experimental samples, we collected vinegars in commercial markets, not spirit vinegars but traditional fermented vinegars. We analy
1. Selection of physiologicaly active sample from traditional fermented vinegars
▪ Physicochemical properties of traditional fermented vinegars
In order to select experimental samples, we collected vinegars in commercial markets, not spirit vinegars but traditional fermented vinegars. We analyzed physiochemical properties (total acidity, acetic acid concentration, total nitrogen, total amino acid, free amino acid, total polyphenol, crude polysaccharide) of collected vinegars (6 samples of domestic vinegars and 5 samples of abroad vinegars) Among them, 4 samples (apple vinegar, persimmon vinegar, brown rice vinegar, wine vinegar) of domestic vinegars and 2 samples (brown rice vinegar, wine vinegar) of abroad vinegars were selected for the further studies. The purity of acetic acid of Domestic vinegars are 3~5% lower than abroad vinegars’ and the contents of crude polysaccharide of domestic vinegars are higher than abroad vinegars’.
▪ Isolation and chemical properties of the polysaccharide from traditional fermented vinegars
In order to elucidate the intestinal immune- system modulating activity of traditional fermented vinegar,6 kinds of crude polysaccharides (CP) were isolated from traditional fermented vinegars in domestic or foreign origins, and then their chemical properties and several immuno-stimulating activities were evaluated. Three kinds of crude polysaccharide fractions prepared from Korean traditional brown rice vinegar (Korean black vinegar, KBV-0), Japaness brown rice vinegar (Japanese black vinegar, JBV-0) and Korean persimmon vinegar (KPV-0) showed higher yields and cytokine producing activities on macrophages than other traditional fermented vinegars. Both KBV-0 and JBV-0 had a similar sugar composition (mannose and glucose), but not similar contents of them. KPV-0 was obtained as a higher arabinose and rhamnose contents than KBV-0 or JBV-0.
2. kolation method of functional ingredients from traditional fermented vinegars
In order to scrutinize of functional ingredients in vinegars, sample was extracted through this steps. Each sample, which was Korean persimmon vinegar and Korean brown rice vinegar, was extracted for 24h under room temperature by using 75% of ethanol then took only precipitation, it made solid substance by using evaporator and freezing dryer. Total protein of brown rice vinegar concentrate is 7 times higher than persimmon vinegar concentrates, total protein of brown rice vinegar concentrate is 17%, and total protein of persimmon vinegar concentrate is 2.4%. Total amino acid of brown rice vinegar concentrate is 9 times higher than persimmon vinegar concentrate’s. The 2 types of vinegar contain citric acid, lactic acid, pyroglutaxnic acid. Particularly, the brown rice vinegar has bound form of ferulic acid and the concentration is 47.5㎍/g.
The reactive oxygen species is known as main cause of aging and some kind of diseases in human body. So that reasons, we had test the effect of anti-oxidant activity of Korean brown rice vinegar and Korean persimmon vinegar into ethanol-treated hepatic cells. In this research, Korean brown rice vinegar and Korean persimmon vinegar are verified that has anti-oxidant activity. The superoxide dismutase is slightly increased in damaged hepatic cells.
3. Estimation for intestinal immue-modulating activity of traditional fermented vinegars
▪ Elucidation of active modes of intestinal immue-modulating polysaccharides from traditional fermented vinegars (in vitro)
Various immuno-stimulating activities of KBV-0, KPV-0 and JBV-0 were estimated. Anti-complementary activities of KBV-0, KPV-0 and JBV-0 were increased dose-dependently but KBV-0 and KPV-0 showed higher anti-complement activity (62 and 65% of DIW control) than JBV-0 at 1,000 ug/mL. Results obtained by crossed immunoelectrophoresis using anti-human C3 and anti-complementary activity in the absence of Ca ion suggested complement activation by KPV-0 is via both classical and alternative pathways. In an in vitro cytotoxicity analysis, KBV-0, KPV-0 and JBV-0 did not affect the growth of peritoneal macrophages, RAW 264.7 cells and Caco-2 cells. KBV-0, KPV-0 and JBV-0 significantly augmented the production of nitric oxide (NO), IL-6, IL-12 and TNF-α in a dose dependent manner as well as their mRNA expressions. However the activity of KPV-0 was the most potent in the tested polysaccharides. In order to assess phagocytosis activity, the effects of vinegar polysaccharides on mRNA expression of Fc receptor II (FcRII) was also determined by PCR products. Only KPV-0 showed enhanced expression of mRNA expression for FcRII by dose dependent manner whereas KBV-0 and JBV-0 did not affect the FcRII expression. In an in vitro assay for intestinal immune modulating activity, KBV-0, KPV-0 and JBV-0 augmented bone marrow cell proliferation through Peyer’s patch and the production of IgA and TGF-β by Peyer’s patch cells in a dose-dependent manner. However the activity of KPV-0 was more potent.
▪ Purification of intestinal immue-modulating polysaccharides from traditional fermented vinegars and their chemical and structural characterization
On the other hands, to identify and characterize the immunomodulating ingredient of KBV-0 and KPV-0, they were further fractionated by Sephadex G-75 gel filtration chromatography. Three polysaccharide fractions (KBV-I, II and III) with different MWs were obtained from the crude polysacchride (KBV-0), and KPV-I, II and III were from KPV-O. The high molecular weight polysaccharide fraction, KBV-I was estimated as 60 kDa of MW and it mainly consisted of neutral sugar (96.9%) such as mannose (58.4%), galactose (12.1%) and Glc (13.3%). KPV-I was estimated as 60 kDa polysaccharide that consisted of neutral sugar (85.4%) such as arabinose (31.7%), mannose (19.6%) and galactose (15.2%), and uronic acid (146%). KBV-I and KPV-I were reacted with P -glucosyl Yariv reagent, suggesting the presence of an arabino-β-3,6-galactan moiety. All of the purified fractions did not affect the growth of peritoneal macrophages from Balb/c mice, RAW 274.7 murine macrophage cell lines or Caco - 2 human epithelial colorectal cell lines. KPV-I showed a significantly higher production of NO and various cytokines such as IL-6, IL-12 and TNF-α from peritoneal macrophage of Balb/c mice than other fractions.
Methylation analysis indicated that KBV-I comprised 25 different glycosyl linkages and it existed as the mixture composed of three different polysaccharides such as mannan (60%), rhamnogalacturonan I (RG-I, 30%) and glucan (10%). A mannan residue in KBV-I contained several characteristic mannopyranosyl linkages such as terminal-, 2- and 2,6-linked Manp, suggesting mannan originated from the cell walls of yeasts. A RG-I residue in KBV-I was composed of rhamnogalacturonan core substituted with neutral carbohydrate side chains such as arabinan, galactan and arabinogalactans and related oligosaccharides. It supposed that the potent inmuno-stimulating activity of KBV-I may be due to the mannan from yeast cell walls and RG-I from the pectin of brown rices which was released during fermentation process. On the other hand, KPV-I contained 21 different glycosyl linkages, suggessing the mixture composed of three different polysaccharides such as rhamnogalacturonan RG-I (70%), mannan (20%), and glucan (10%). A RG-I residue in KPV-I comprised several glycosidic linkages such as 5-linked Araf 3-linked Galp and 2,4-Rhap, being characteristic glycosidic linkages in RG-I region of pectin. A mannan residue in KPV-I contained several characteristic mannopyranosyl linkages such as terminal-, 2- and 2,6-linked Manp, expecting mannan originated from yeast cell wall. It also supposed that the potent activity of KPV-I may be mainly due to the yeast mannan and persimmom RG-I.
▪ Establishment of standard component sugars and specifications of intestinal immune-modulating polysaccharide
In component sugar analysis, KBV-0 included 62.9% total sugar contents by dry mass mainly consisted of Glc and Man (36.6 and 13.7%) in addition to small amout of Gal, Xyl and Ara (5.2, 3.8 and 2.9%). KPV-0 contained similar total sugar contents (61.5% of dry mass) with KBV-0, but different composition such as Man, Ara, Gal, Glc, Xyl and Rha (15.6, 12.5, 10.4, 9.9, 6.3 and 6.2%, respectively). As these results, we suggest that immunostimulating polysaccharides, KBV-0 should contain mannose over 10%, and KPV-0 should contain arabinose over 9.0% as each marker compound to be possible to use as functional material for the intestinal immune enhancement.
▪ Estimation of intestinal immune-modulating activity by oral administration of the polysaccharides from traditional fermented vinegars (in vivo)
To investigate the in vivo effects of polysaccharides isolated from traditional fermented vinegars on the intestinal immune system modulating activity, KBV-0 and KPV-0 were administered orally into the mice of each four experimental groups (0, 50, 500 and 5,000㎍/mouse/day, 20 days). In this results, oral administration of KBV-0 and KPV-0 induced the increased production of not only IgA but also various cytokines (IL-6, GM-CSF and TGF-P) by Peyer’s patch cells, in a dose dependent manner. Also, the groups fed with KBV-0 and KPV-0 markedly increased the IgA production into intestinal fluids and feces. However, oral administration of KPV-0 was more effective at the same dosages than that of KBV-0. On the other hand, IL-6 and GM-CSF secretion in serum did not show significant increase in the groups fed with KBV-0 and KPV-0 in comparison with negative control (NC, water administrated group). Above data lead us conclude that Korean traeitional vinegars contains select polysaccharides in addition to seasoning components, and these polysaccharides appear to provide intestinal immune- stimulating activities beneficial to human health.
4. Estimation of intestinal immune function of traditional fermented vinegars in IBD models (in vivo)
To evaluate the efficacy of persimmon vinegar (PV) and unpolished rice vinegar (UV) on gut immune system in DSS—induced colitis mouse model,forty male C57BL6 mice were randomized into five groups; DSS control (DSS), DSS PV concentrate 200 mg/kgBW (DPL), DSS PV concentrate 400 mg/kgBW (DPH), DSS UV concentrate 200 mg/kgBW (DUL), DSS UV concentrate 400 mg/kgBW (DUH). Test materials were orally administered for 23 days and DSS was administered for 9 days after 2 weeks of starting the administration of test materials. DAI tends to be decreased in DPL group. Colonic pathological score was significantly decreased in DPH group compared with DSS group. Inflammation, cell death and regeneration score also showed significant effect in DPH group. mRNA expressions of IL-1β TNF-α and IL-6 were evaluated using qPCR and TNF-α tended to be decreased in DPL group compared with DSS group. Taken together, present Endings suggest that PV concentrate had a regulatory effect on gut immune system by decreasing inflammatory cytokine expression.
5. Estimation of liver-protective effects of traditional fermented vinegars (in vivo)
To evaluate the efficacy of persimmon vinegar (PV) and its fractions on hepatic immune response and alcohol metabolism in chronically alcohol administered rats, forty male Wistar rats were randomized into five groups; normal control (NC), ethanol control (EC), ethanol PV (PT), ethanol insoluble PV fraction (PI), and ethanol soluble fraction of PV (PS). After four weeks, increases in hepatic mRNA expressions of IL-1β, EL-12β, TLR-4 and COX-2 were significantly dampened in PV, PT, and PS groups compared to ET. Histological observation also revealed effects of PV, PT, and PI on ethanol-induced mild steatosis compared to the ET group. CYP2E1 protein expression was significantly suppressed only in the PT group compared to the EC group. Taken together, present findings suggest that PV and its fractions had a hepatoprotective effect on ethanol-induced inflammation and oxidative stress via regulation of alcohol metabolism and anti-inflammatory response system.
(출처 : SUMMARY 14P)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제 출 문 ... 2
- 연 구 진 ... 3
- 요 약 문 ... 4
- SUMMARY ... 14
- CONTENTS ... 19
- 연구개발보고서 초록 ... 21
- 목차 ... 27
- 제1장 연구개발 과제의 개요 ... 29
- 제1절 연구개발의 목적 및 필요성 ... 29
- 제2절 연구 내용 ... 35
- 1. 전통발효식초의 시료 선정 ... 35
- 2. 전통발효식초의 기능성 성분 분획법 수립 ... 35
- 3. 전통발효식초의 장관면역 기능성 평가 ... 35
- 4. 전통발효식초의 간 보호 효과 평가 ... 35
- 제2장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 36
- 제1절 전통발효식초의 이화학적 분석을 통한 시료 선정 ... 36
- 1. 식초 시료 Screening ... 36
- 2. Screening 시료 분석 ... 37
- 제2절 전통발효식초로부터 면역 활성이 우수한 다당체의 분리 및 우수 식초의 선별 ... 40
- 1. 연구방법 ... 40
- 2. 연구결과 ... 43
- 제3절 전통발효식초의 특성에 따른 분획법 수립 및 분획물 확보 ... 49
- 1. 연구방법 ... 49
- 2. 연구결과 ... 52
- 제4절 전통발효식초의 장관면역계 활성(장관면역 증진) 기능 평가 ... 64
- 1. 연구방법 ... 64
- 2. 연구결과 ... 78
- 제5절 전통발효식초의 장관면역계 효능(면역 관용) 평가 ... 133
- 1. Inflammatory bowel disease (IBD) 동물모델 선정 ... 133
- 2. 실험디자인 ... 134
- 3. 연구결과 ... 136
- 제6절 전통발효식초의 간 보호 효과 평가 (in vitro) ... 146
- 1. 연구방법 ... 146
- 2. 연구결과 ... 149
- 제7절 전통발효식초의 간 보호 효과 평가 (in vivo) ... 156
- Ⅰ. 전통발효식초의 간 보호 효과 평가(in vivo) ... 156
- 1. 연구 방법 ... 156
- 2. 분석 지표 ... 158
- 3. 연구결과 ... 166
- 4. 요약 ... 184
- 5. 고찰 ... 188
- Ⅱ. 전통발효식초 분획물의 간 보호 효과 평가(in vivo) ... 191
- 1. 실험디자인 ... 191
- 2. 연구결과 ... 194
- 3. 전통발효식초 분획물의 in vivo 간 건강 기능성 평가 결론 ... 207
- 제3장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 208
- 제4장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 213
- 제5장 연구개발과정에서 수집한 해당과학기술정보 ... 214
- 제6장 주요 연구사항에 대해 시행기관의 장이 요구하는 사항 ... 214
- 제7장 연구시설·장비 현황 ... 214
- 제8장 참고문헌 ... 215
- 끝페이지 ... 221
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