초록 ▼

농산물의 통관과정에서 발견되는 해충에 대한 신속한 동정법은 농산물 수출지연에 따른 경제적 손실을 방지하기 위한 중요한 요소이다. 우리나라의 주요 수출품인 사과, 복숭아, 배 등의 과실류에서 발견되는 복숭아순나방의 신속한 동정을 위한 간이진단킷트용 marker 개발을 위하여 복숭아순나방과 복숭아순나방붙이 유충에 대한 전사체를 454 pyrosequencing을 실시하여 분석하였으며 각 전사체 분석 결과를 복숭아심식나방의 전사체 분석 결과와 통합하여 분석함으로써 복숭아심식나방에서 개발한 27 kDa 단백질이 복숭아순나방과 복숭아순나방붙

농산물의 통관과정에서 발견되는 해충에 대한 신속한 동정법은 농산물 수출지연에 따른 경제적 손실을 방지하기 위한 중요한 요소이다. 우리나라의 주요 수출품인 사과, 복숭아, 배 등의 과실류에서 발견되는 복숭아순나방의 신속한 동정을 위한 간이진단킷트용 marker 개발을 위하여 복숭아순나방과 복숭아순나방붙이 유충에 대한 전사체를 454 pyrosequencing을 실시하여 분석하였으며 각 전사체 분석 결과를 복숭아심식나방의 전사체 분석 결과와 통합하여 분석함으로써 복숭아심식나방에서 개발한 27 kDa 단백질이 복숭아순나방과 복숭아순나방붙이, 복숭아심식나방의 유충에서 공통적으로 발현이 되는 것을 확인하였다. 이렇게 전사체 분석 결과를 바탕으로 종간에 높은 다양성을 가지는 27 kDa 단백질을 종 구분 marker 로 선별하였고 복숭아순나방에 대한 27 kDa 유전자를 cloning 한 후 대장균을 이용하여 복숭아순나방 27 kDa 단백질에 대한 재조합 단백질을 생산하였다. 생산된 재조합 단백질은 정제 과정을 거친 후 항원으로 활용하여 mouse에 면역반응을 유발하였고 polyclonal 항체 생성 여부확인 후 췌장을 적출하여 SP2/0-Agl4 myeloma cell과의 fusion을 진행하였다. fusion 후 형성되는 colony를 가지고 hybridoma screening을 실시하여 단일클론항체를 생산하는 hybridoma 세포주를 선별하였고 선별된 세포주가 생산하는 단일클론항체를 확보하였으며 결합특이성검정 및 복숭아순나방 및 유사나방류 유충에 대한 종특이적 구분 특성을 조사한 결과 확보된 단일클론항체는 복숭아순나방과 복숭아순나방붙이에 대하여 특이적인 결합을 하는 것을 확인할 수 있었으며 유사해충인 복숭아심식나방 대해서는 특이적 결합이 검출되지 않았다. 확보된 27 kDa 단백질에 대한 단일클론항체와 다클론항체를 이용하여 샌드위치 방식의 ELISA 진단방법을 확립하였으며 최종적으로 4시간이내 복숭아순나방에 대한 진단이 가능한 간이진단킷트를 완성하였다.

(출처 : 연구결과보고서 요약문 5p)

Abstract ▼

Rapid identification of pest species found under quarantine is an important factor in preventing an economic loss of agricultural commodities. In this study, we analyzed RNA-Seq of the larvae of C. sasakii, G. molesta and G. dimorpha, which are serious pests in several fruits in Korea and are diffic

Rapid identification of pest species found under quarantine is an important factor in preventing an economic loss of agricultural commodities. In this study, we analyzed RNA-Seq of the larvae of C. sasakii, G. molesta and G. dimorpha, which are serious pests in several fruits in Korea and are difficult to discriminate by species in their larval stage because of lack of a morphological character. To select immunological diagnostic markers, discriminating the larvae of C. sasakii from the G. molesta and G. dimorpha, RNA-Seq was performed for the larvae of the three insects. From a 454 pyro-sequencing, bioinformatical screening, literature search, and gene expression study resulted 27 kDa glycoprotein as a species discrimination marker candidate. Cloning the gene and recombinant protein production in E. coli expression system followed by immunization and monoclonal antibody production using the recombinant protein as an antigen, a monoclonal antibody was successively produced from a cloned hybridoma cell line. Characterization of the antibody using western blot analysis, ELISA showed the monoclonal antibody can successively discriminate G. molestar and G. dimorpha from C. sasakii in their larvae and pupae stage. No non specific cross reaction was detected in direct and indirect ELISA. We finally completed a Sandwich ELISA diagnosis kit for discriminating G. molestar and G. dimorpha from C. sasakii within four hours using the monoclonal antibody and a polyclonal antibody for 27 kDa glycoprotein of G. molestar.

(출처 : Summary 6p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 용역연구사업 연구결과보고서 ... 2
• 제 출 문 ... 3
• 목차 ... 4
• 연구결과보고서 요약문 ... 5
• Summary ... 6
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 7
• 1.1. 총괄연구개발과제의 목표 ... 7
• 1.2. 총괄연구개발과제의 목표달성도 ... 7
• 1.3. 국내·외 기술개발 현황 ... 8
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ... 9
• 가. 연구방법 ... 9
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ... 13
• 가. 복숭아순나방, 복숭아순나방붙이, 복숭아심식나방의 확보 및 시료의 확인 ... 13
• 나. 복숭아순나방, 복숭아순나방붙이 전사체 분석 ... 13
• 다. 복숭아순나방과 복숭아순나방붙이에서 주요 타겟 후보군의 발생단계별 유전자 발현 조사 ... 16
• 라. 27 kDa 단백질의 클로닝 및 발현시스템 구축 ... 16
• 마. 복숭아순나방 27 kDa 재조합 단백질의 확보 ... 19
• 바. 27 kDa 단백질에 대한 단일클론항체 확보 ... 19
• 사. Anti-27 kDa monoclonal antibody의 특성규명 ... 21
• 아. 토끼로부터 27 kDa 단백질에 대한 다클론항체 확보 ... 23
• 자. 단일클론항체 항체 역가 측정 및 복숭아순나방 결합특이성 검정 ... 24
• 차. Mouse ascite 제작 및 다량 생산 ... 25
• 카. Mouse ascites 항체 역가 검정 및 복숭아순나방 결합특이성 검정 ... 26
• 타. 복숭아순나방/복숭아심식나방 교차 면역반응 검정 ... 27
• 파. Sandwich ELISA 간이진단킷트 구성 ... 27
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 29
• 가. 복숭아순나방 유충의 확보 및 barcode 분석 ... 29
• 나. 복숭아순나방 특이적 단일클론항체 생성을 위한 단백질 후보군 선정 ... 29
• 다. 복숭아순나방 특이적 단일클론항체의 확보 및 특성조사 ... 29
• 라. 복숭아순나방과 복숭아심식나방 유충의 간이진단법 확립 ... 29
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 31
• 5.1. 활용성과 ... 31
• 5.2. 활용계획 ... 32
• 제6장 기타 중요변경사항 ... 33
• 제7장 참고문헌 ... 34
• 제8장 첨부서류 ... 36
• 붙임 1. 복숭아순나방 및 유사해충의 ELISA 간이 진단법 ... 39
• 끝페이지 ... 48