초록 ▼

인간 줄기세포 기반 간세포 분화 원천기술 개발 및 간세포 독성·약효 시스템 구축과 독성 분자지표 탐색 시스템 구축을 위하여 아래와 같은 내용으로 연구를 수행함.
첫째, 인간 줄기세포 유래 간세포의 검증을 위한 QA/QC 시스템을 확립함. 간세포 고유의 생리학적 활성능력, 약물대사 능력 등을 정밀하게 검증하는 간세포 QA/QC 시스템을 개발, 구축하여 고품질 간세포 생산 시스템 확립에 활용함. 이에 간분화 특이적 유전자 발현, FACS 분석 및 일반적 간세포 독성분석을 통하여 분화된 간세포의 분화도 및 성숙도를 검증하고 기술개발

인간 줄기세포 기반 간세포 분화 원천기술 개발 및 간세포 독성·약효 시스템 구축과 독성 분자지표 탐색 시스템 구축을 위하여 아래와 같은 내용으로 연구를 수행함.
첫째, 인간 줄기세포 유래 간세포의 검증을 위한 QA/QC 시스템을 확립함. 간세포 고유의 생리학적 활성능력, 약물대사 능력 등을 정밀하게 검증하는 간세포 QA/QC 시스템을 개발, 구축하여 고품질 간세포 생산 시스템 확립에 활용함. 이에 간분화 특이적 유전자 발현, FACS 분석 및 일반적 간세포 독성분석을 통하여 분화된 간세포의 분화도 및 성숙도를 검증하고 기술개발에 활용함.
둘째, 인간 줄기세포로부터 간세포 생산기술 표준화 시스템을 구축함. 이를 위하여 인간 줄기세포로부터 간세포 분화를 유도하는 고효율 분화 프로토콜을 신규개발하고 독성·약효 검사를 위한 간세포 배양기술을 최적화함. 이에 간성상세포를 이용한 공동세포배양기술을 기반으로 간세포 성숙도를 증진시키는 원천기술을 개발하였으며 또한 레티노익산 기반기술 및 신규 간성숙세포 판별기술을 개발함.
셋째, 인간 줄기세포 유래 간세포 독성 평가 시스템을 구축하여 약물처리에 따른 간세포 독성반응을 다각적으로 세분화하여 종합적으로 분석하는 독성 평가시스템을 확립함. 특히 간세포 면역독성물질 발굴기술을 도입하여 확립하였으며 다양한 간독성약물에 적용하여 이를 검증하였음. 인간 줄기세포 유래 간세포의 분비대사체 분석연구를 통하여 TZD 약물에 따른 독성대사를 분석,연구하였음.
넷째로 신규약물 약효평가를 위하여 줄기세포 유래 분화 간세포 시스템을 전방위적으로 활용하여 TNP약물의 간독성 보호효능을 신규 발굴하여 검증함.
다섯째, 이러한 본 인간 줄기세포 기반 간세포 독성·약효 평가 시스템을 바이오 산업적 적용을 최종목적으로 HTS (High Throughput Screening) 플랫폼에 기반한 간세포 배양기술과 독성평가 제반 시스템으로서 연구개발에 성공함.

( 출처 : 보고서 요약서 3p )

Abstract ▼

Purpose &Contents
The goals of this proposal are to
1. establish a highly efficient standard protocol to produce hepatocytes defferentiated from human embryonic stem cells.
2. develop and utilize hepatocyte quality assurance/quality control (QA/QC) system to evaluate human embryonic stem ce

Purpose &Contents
The goals of this proposal are to
1. establish a highly efficient standard protocol to produce hepatocytes defferentiated from human embryonic stem cells.
2. develop and utilize hepatocyte quality assurance/quality control (QA/QC) system to evaluate human embryonic stem cell-derived hepatocyte differentiation.
3. set up a stem cell-derived hepatocyte toxicity evaluation system based on general toxicology, metabolomics, toxicogenomics, and immunotoxicology, thereby establishing an infrastructure for discovering and validating novel predictive hepatotoxicity biomarkers.
4. standardize the human embryonic stem cell-derived hepatocyte toxicity·efficacy evaluation system and further combine it with high throughput screening (HTS) technology.

We performed following subdivided subjects over the past five years.
1. Establishment of human embryonic stem cell-derived hepatocytes in culture:
- Development and optimization of the best cell culture protocol for obtaining hepatocytes differentiated from human embryonic stem cells.
2. Foundation of hepatocyte QA/QC system:
- Setting up the highly efficient QA/QC system which will be used to evaluate physiological properties of differentiated hepatocytes.
3. Establishment of hepatocyte toxicity evaluation system:
- Examining drug toxicity and toxic responses throughout general toxicology, metabolomics, toxicogenomics as well as immunotoxicity.
4. Establishment of 96-well HTS compatible hepatocyte culture
- Generating HTS-format culture of differentiated hepatocytes from pluripotent stem cells as well as testing its use for large scale screening for drug toxicity and efficacy.

Results
1. We successfully developed a QA/QC evaluation system for human stem cell-derived hepatocytes by monitoring cellular characteristics such as hepatocyte-specific physiological functions, hepatocyte-specific drug metabolism capacity. Thus, our system has been utilized to routinely examine our stem cell-derived hepatocyte cultures throughout checking hepatocyte-specific gene expression, FACS (fluorescence activated cell sorting) analysis, as well as general hepatotoxicity.
2. Our group established novel hepatocyte maturation protocols which facilitates the cell maturation in a highly efficient manner. By co-culturing human stem cell-derived hepatocytes with hepatic stellate cells, the cellular maturation was significantly increased. Associated technologies include retinoic acid-mediated hepatocyte maturation as well as STRA6-based hepatocyte sorting.
3. We performed genome-wide microarray analysis by using our stem cell-derived hepatocytes and compared our database to human hepatocyte gene profiles. Identification of specific differences in gene expression patterns allowed us to better evaluate our cell culture systems and further direct the development of high quality hepatocyte production technologies.
4. On the basis of currently-established hepatocytes derived from human stem cells, our groups established the system for detecting immunotoxic factors produced from hepatocyte cultures in response to hepatotoxic drugs such as acetaminophen. Moreover, we analyzed immunotoxic as well as secretome-based metabolomic profiles by using hepatocytes exposed to TZD drugs such as troglitazone, and obtained drug-specific changes which can be used for improtant database for drug toxicity evaluation and drug discovery.
5. In addition to drug toxicity test, we attempted to identify novel drug functions and discover protective effects of TNP (N(2)-(m-(trifluoromethy)lbenzyl) N(6)-(p-nitrobenzyl)purine) from acetaminophen-induced hepatotoxicity in our stem cell-derived hepatocyte culture systems. Further analysis by using classical cell and animal systems confirmed the validity of our findings, which support the suitability of our stem cell-based hepatocyte screening system for evaluating drug efficacy and toxicity.
6. We further successfully developed the cell differentiation/plating procedure for 96-well plate format which is considered as a gold-standard for high throughput screening (HTS) at the industry level.

Expected Contribution
During the past fiver years (2012-2017), our group successfully applied for 10 patents (4 international, 6 domestic patents) and registered 5 patents (1 USA, 1 Japan. 3 domestic patents). In addition to making significant contributions on the field of stem cell biology, we ultimately aim to utilize our database and technological advances in biotechnological areas such as drug development and toxicity screening via technology transfer.

( 출처 : SUMMARY 6p )

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 국문 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 6
• CONTENTS ... 8
• 목 차 ... 9
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 10
• 제1절 연구개발과제의 목적 ... 10
• 제2절 연구개발대상 기술의 경제적 중요성 및 연구개발의 필요성 ... 10
• 제3절 본 연구개발의 범위 ... 21
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 21
• 제 1 절 세계적 수준 ... 21
• 제2절 국내수준 ... 25
• 제3절 국내외 연구현황 ... 25
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 29
• 제1절 인간줄기세포 유래 간세포 분화기술 ... 29
• 제2절 분화 간세포 QA/QC 시스템 및 신규 간성숙 프로토콜 구축연구 ... 44
• 제3절 줄기세포 유래 간세포 면역독성 분석시스템 개발연구 ... 88
• 제4절 줄기세포 유래 간세포 대사체 분석시스템 개발연구 ... 112
• 제5절 인간 줄기세포 유래 간세포 활용 약물효능 평가연구 ... 119
• 제6절 줄기세포 유래 간세포 독성분석 HTS 시스템 개발연구 ... 134
• 제4장. 목표 달성도 및 관련 분야 기여도 ... 153
• 1. 목표 달성도 ... 153
• 2. 관련 분야 기여도 ... 154
• 제5장. 연구개발성과의 활용계획 ... 155
• 제6장. 연구 과정에서 수집한 해외 과학기술 정보 ... 157
• 제7장. 연구개발성과의 보안등급 ... 159
• 제8장. 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비 현황 ... 160
• 제9장. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전 조치 이행 실적 ... 161
• 제10장. 연구개발과제의 대표적 연구 실적 ... 162
• 제11장. 기타 사항 ... 163
• 제12장. 참고 문헌 ... 164
• 끝페이지 ... 166