초록 ▼

연구의 목적 및 내용
1) 불용성 다당을 생산하는 활성을 가지는 탄수화물 효소의 특성을 활용하여 신개념 융합단백질 효소발현, 정제, 및 고정화 시스템의 개발
2) 이를 바탕으로 다양한 탄수화물 활성 효소에 융합을 적용한 후 이들을 조합하여 반응에 근거한 다양한 기능성 소재의 생합성을 연구

연구결과
1차 년도(2014)
1) Amylosucrase와 model protein의 유전자적 융합효소 발현 시스템 개발
▪ Green fluorescent protein (GFP)와 β-glucosidas

연구의 목적 및 내용
1) 불용성 다당을 생산하는 활성을 가지는 탄수화물 효소의 특성을 활용하여 신개념 융합단백질 효소발현, 정제, 및 고정화 시스템의 개발
2) 이를 바탕으로 다양한 탄수화물 활성 효소에 융합을 적용한 후 이들을 조합하여 반응에 근거한 다양한 기능성 소재의 생합성을 연구

연구결과
1차 년도(2014)
1) Amylosucrase와 model protein의 유전자적 융합효소 발현 시스템 개발
▪ Green fluorescent protein (GFP)와 β-glucosidase를 포함하는 융합 construct 제작
▪ Amylosucrase와 model protein 사이에 GS 및 EstO linker를 포함하는 융합 construct 제작
▪ E. coli를 통한 융합 효소의 발현
2) 융합 효소의 발현 및 특성 확인
▪ Foreign gene으로 융합 적용된 GFP와 β-glucosidase의 발현 및 활성 확인
▪ GS 및 EstO linker를 포함하는 foreign gene의 발현량 및 specific activity 확인
▪ Amylosucrase의 glucan 형성을 이용한 고정화 효소로의 이용 및 one-step purification 적용
2차 년도(2015)
1) Amylosucrase와 다양한 효소(중온성, 고온성, 초고온성)의 융합효소 발현
▪ 14종류의 다양한 (중온성, 고온성 및 초고온성) 탄수화물 효소의 유전자 획득 및 E. coli 발현
▪ 발현된 효소의 활성 측정, 최적온도, pH 및 최적 기질 탐색 등의 효소학적 특성 확인
2) Amylosucrase와 다양한 효소의 융합효소 발현 검증 및 다단계 반응관련 효소의 융합효소 발현 및 단일-스텝 고정화
▪ Amylosucrase와 탐색한 9 종류의 탄수화물 효소 유전자와의 융합 단백질 발현 벡터의 제작 및 E. colil 발현
▪ 발현된 융합 단백질의 활성 측정, 최적온도, pH 및 최적 기질 탐색 등의 효소학적 특성 확인
3차 년도 (2016)
1) Cellulose 분해 효소와 amylosucrase의 융합 효소를 활용한 biofuel 소재의 합성
▪ Endoglucanase의 기질 특이성 및 effertor 영향 확인
▪ Amylosucrase와 융합된 endoglucasnase와 β-glucosidase를 이용한 biofuel 소재 합성
▪ Biofuel 소재의 최적 융합효소 반응조건 도출 및 합성 수율 검증
2) 탄수화물 활성 효소의 연속 반응을 이용하여 기능성 식품 및 의약품 소재의 생합성
▪ Amylosucrase와 융합된 trehalose 및 kojibiose phosphorylase의 N-/C- 말단 위치에 따른 활성 확인
▪ 융합된 trehalose 및 kojibiose phosphorylase의 glucan 생성 특징 확인
▪ 융합된 효소들의 조합된 연속 효소반응을 통한 selaginose의 생합성 및 반응 재사용성 확인

연구결과의 활용계획
1) 신개념 융합효소 기술은 일반적인 생명공학 연구 전반에 활용이 가능한 기술이며 여러 기초 및 응용연구에 필요한 기반 기술로 사용될 수 있음. 또한 산업적인 효용가치가 매우 클 것으로 기대됨
2) 자연계에 존재하거나 존재하지 않는 물질이 효소적 방법으로 생합성 될 수 있다는 근거를 제시함. 따라서 고부가가치의 소재가 있다면 그 구조에 따라서 관련된 효소의 조합을 통하여 새롭게 합성할 수 있다. 따라서 본 연구의 결과는 새로운 고부가가치 생명산업소재 생산에 적극 활용이 가능함
3) 더불어 combinatorial glyco-enzymology라는 새로운 학문 분야 개척과 응용 효소공학에 있어 선도적 위치를 차지할 수 있는 계기를 마련하고 이 분야의 능력있는 새로운 신진인력 양성에 도움을 주어 기초, 응용 학문에 고른 실력을 겸비하고 산업적 활용 능력을 갖춘 유능한 연구인력 배출할 수 있을 것으로 기대됨

(출처 : 한글요약문 4p)

Abstract ▼

Purpose& contents
1) Development of a new enzyme reaction-based purification and immobilization system based on the characteristics of a carbohydrate-active enzyme, which has an ability to synthesize insoluble glucan.
2) Research and development of the biosynthesis of various functional bio-ma

Purpose& contents
1) Development of a new enzyme reaction-based purification and immobilization system based on the characteristics of a carbohydrate-active enzyme, which has an ability to synthesize insoluble glucan.
2) Research and development of the biosynthesis of various functional bio-materials based on combinatorial reaction of fusion enzyme applied to various carbohydrate active enzyme

Result
The first year (2014)
1) Development of genetic fusion enzyme expression system of amylosucrase and model protein
▪ Construction of fusion vector containing green fluorescent protein (GFP) and β-glucosidase
▪ Construction of fusion vector containing GS and EstO linker between amylosucrase and model protein
▪ Cloning and expression of fusion enzyme in E. coli
2) Expression of fusion enzyme and enzymatic characterization
▪ Expression and activity assay of GFP and β-glucosidase fused as foreign gene
▪ Measurement of expression ratio and specific activity of foreign gene containing GS and EstO linker
▪ Application of fusion enzyme as one-step purification method and immobilized enzyme using glucan synthesized by amylosucrase
The second year (2015)
1) Cloning and expression of fusion enzymes of amylosucrase and various enzymes (meso-, thermo-, and hyperthermophilic)
▪ Obtaining and cloning of 14 defferent kinds of carbohydrate enzyme gene in E. coli
▪ Enzymatic characterization of expressed enzyme, such as activity assay, optimum pH/temperature and substrate specificity
2) Verification of expression of various enzyme fused to amylosucrase, and one step purification and immobilization of expressed fusion enzyme, related to cascade reaction
▪ Construction of 9 different amylosucrase-fusion protein expression cassettes and their expression in E. coli
▪ Enzymatic characterization of fusion enzyme, such as activity assay, optimum pH/temperature and substrate specificity
The third year (2016)
1) Production of biofuel material using fusion enzyme of amylosucrase and cellulose degrading enzyme
▪ Enzymatic characterization of endoglucanase, such as substrate specificity and ion effect
▪ Production of biofuel meterial using fusion enzyme of amylosucrase and endoglucanase or β-glucosidase
▪ Optimum production and production yield of amylosucrase and cellulose degrading enzymes
2) Biosynthesis of functional foods and pharmaceutical materials using continuous reaction of carbohydrate active enzymes
▪ Identification of the activity of trehalose or kojibiose phosphorylase fused to amylosucrase by N-/C-terminal position
▪ Characterization of glucan production of fusion enzyme
▪ Production of selaginose using continuos reaction of fusion enzyme and reuse of it

Expected Contribution
1) Amylosucrase-fusion protein is a new concept biotechnology skill to be utilized in various biological researches. In addition, it can be applied for applied sciences as well as basic researches. Furthermore, its usage can be expanded to the industrial areas.
2) It supports the possibility that natural and unnatural products can be synthesized using enzymatic technology. If there is high value-materials, new products can be synthesized using combination of enzymes based on the structure of products. Therefore, the results of this study can be highly utilized in field of creating a high value biotechnology product
3) It will prepare the leading position related to disciplines of combinatorial glyco-enzymology and application of enzyme engineering. In addition this area of research will train competent researcher having basic science mind and application ability, who fit into the emerging human resources

(출처 : SUMMARY 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 2
• 연구계획 요약문 ... 3
• 연구결과 요약문 ... 4
• 한글요약문 ... 4
• SUMMARY ... 5
• 연구내용 및 결과 ... 6
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 11
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 13
• 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 53
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 56
• 6. 연구과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ... 58
• 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 58
• 8. 참고문헌 ... 59
• 9. 연구성과 ... 60
• 10. 국가과학기술지식정보서비스에 등록한 연구시설·장비 현황 ... 65
• 11. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 66
• 12. 기타사항 ... 71
• 별첨1 ... 72
• 별첨2 ... 87
• 끝페이지 ... 99