보고서 정보
주관연구기관 |
전남대학교 Chonnam National University |
연구책임자 |
임영준
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2017-05 |
과제시작연도 |
2016 |
주관부처 |
과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT |
등록번호 |
TRKO201800004453 |
과제고유번호 |
1711037128 |
사업명 |
개인연구지원 |
DB 구축일자 |
2018-04-28
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키워드 |
카테닌.암전이.세포접착.캐더린.단백질 상호작용.구조생물학.전사조절인자.결정학.신호전달.catenin.cancer metastasis.cell adhesion.cadherin.protein interaction.structural biology.transcription factor.crystallography.signal transduction.
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201800004453 |
초록
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연구의 목적 및 내용
■ 본 연구에서는 d-Catenin 및 adhesion 분자들의 네트워킹을 통한 신호 조절 기전을 구조적으로 이해하고자 하였다. d-Catenin, E-cadherin, presenilin, Densin-180 등 다양한표적 단백질들의 3차 분자구조를 규명하여 단백질 상호작용 분석하고 구조에 근거한 생화학적 조절 기전을 규명하고자 하였다. 단백질 결정화의 특성상 표적 단백질이 의도대로 결정화되는 것은 아니며, 어떤 표적이 결정화에 성공할지는 예측하기 어려우므로,연구 과정에서 표적단백질을 다양화하고, 여러
연구의 목적 및 내용
■ 본 연구에서는 d-Catenin 및 adhesion 분자들의 네트워킹을 통한 신호 조절 기전을 구조적으로 이해하고자 하였다. d-Catenin, E-cadherin, presenilin, Densin-180 등 다양한표적 단백질들의 3차 분자구조를 규명하여 단백질 상호작용 분석하고 구조에 근거한 생화학적 조절 기전을 규명하고자 하였다. 단백질 결정화의 특성상 표적 단백질이 의도대로 결정화되는 것은 아니며, 어떤 표적이 결정화에 성공할지는 예측하기 어려우므로,연구 과정에서 표적단백질을 다양화하고, 여러 호몰로그를 표적으로서 시도함으로서 성공 가능성을 높이는 것이 합리적인 접근 방법이다. 이 외에도 표적을 다양화 하여 Osh1 ANK 도메인과 -Nvj1 복합체의 3차 구조를 X-선 결정학으로 규명하고, 구조연구 통하여 Osh1 homolog의 단백질 상호작용 및 어떠한 기전으로 단백질의 기능을 조절하는지 OSBP의 기능을 이해 하고자 하였다.
연구결과
■ d-Catenin 및 interacting partner의 유전자 클로닝 및 단백질 정제 d-catenin 및 이와 상호작용하는 단백질 (E-cadherin JMD, presenilin-1, Densin-180)의 유전자를 대장균에서 단백질을 발현할 수 있는 시스템으로 클로닝. 각 단백질의 기능적으로 중요한 주요 도메인 (ARM, CTD)을 과발현, 정제하여 생화학적 기능 동정 및 결정화를 수행하였다. d-catenein 및 그 외 표적들을 클로닝을 하였다.
■ 표적 단백질의 발현율, 수용성, 결정화 성질들의 개선을 위하여 여러 가지 유전적 변형기법을 시도하였다. 대장균 발현시 수용성이 낮은 delta-Catenin의 domain modification을 시도하여 안정적으로 수용성으로 발현할 수 있는 시스템을 구축하였다. Modified MBP fusion 및 variable loop truncation을 통하여 단백질의 안정성 및 수용성을 개선하였으며이 연구로 개발한 방법을 여러 표적에 적용하여 개선 효과 확인하였다.
■ 표적 단백질인 delta-catenin, cadherin JMD, protein-protein interaction에 관여하는 여러 단백질을 클로닝하고 단백질 발현 시스템을 구축하였다. 수많은 시도와 노력을 하였으나, 계획서에서 초기에 의도와 다르게, 낮은 회절능 또는 X-선 회절 분석에 필요한 결정을 얻지 못하여, 구조규명을 하지 못하여다. 그러나 catenin과 병행하여 진행하였던 Osh1 ankyrin domain-Nvj1, Osh1 ORD-sterol 복합체를 구조와 기능을 규명하였다.
연구결과의 활용계획
■ d-Catenin의 construct 최적화를 위한 다양한 시도를 통하여, Surface entropy reduction, 유사 단백질 서열 및 homology 구조 분석에 근거한 variable loop truncation은 기법을 확립하였다. 이 기술을 단백질의 성질 개선 및 결정화에 일반적으로 응용할 수 있으므로 구조생물학 연구에 활용할 수 있을 것이다. 본 연구와 병행하여 Osh1 단백질의 작용기전을 구조적으로 규명하였고, 이것은 다른 human homolog들의 기능 이해에 도움을 줄 것이다.
( 출처 : 한글요약문 4p )
Abstract
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Purpose&contents
d-Catenin is involved neuronal cell adhesion and tissue morphogenesis by regulating transcription of genes and adhesion molecules. d-Catenin interacts with various partners such as E-cadherin, presenilin, densin to regulate the diverse signaling cascades. To understand the detail
Purpose&contents
d-Catenin is involved neuronal cell adhesion and tissue morphogenesis by regulating transcription of genes and adhesion molecules. d-Catenin interacts with various partners such as E-cadherin, presenilin, densin to regulate the diverse signaling cascades. To understand the detailed regulatory mechanism of d-Catenin, we perform structure determination of d-Catenin and the complex with partner protein and analyse the protein-protein interaction by biochemical and structural studies.
Result
■Target gene cloning and protein expression of d-Catenin and interacting partners:
The key domains of d-catenin and its interacting proteins (E-cadherin JMD,presenilin-1, Densin-180) were cloned into bacterial expression vectors for protein purification. Target proteins were purified to homogeneity for biochemical and crystallographic studies.
■ Various modification of target proteins were tested to improve protein expression,solubility and crystallization properties. d-catenin is insoluble in bacterial expression.
We setup protein production of d-catenin ARM domain in high quantity for protein crystallography by extensive domain modification of d-catenin. We obtained the modification techniques of target proteins by MBP fusion and variable loop truncation, that improve the protein stability and solubility which can be applied to other protein targets.
■ We performed gene cloning and protein purification of d-catenin, cadherin JMD, protein-protein interaction. Even with the intensive trials and errors, because of low diffraction quality of crystallized proteins and failure to crystallize the major target domains, we could not solve the structure of d-catenin. Structural and biochemical studies on other targets such as Osh1 ankyrin domain-Nvj1, Osh1 ORD-sterol complex were successful, leading to determination of structural and functional mechanism of protein.
Expected Contribution
■ The various construct modification techniques involving surface entropy reduction,variable loop truncation, protein fusion were applied to d-catenin ARM domain to obtain stable and soluble protein for crystallization trials. The techniques we discovered can be applied to other target proteins for general protein crystallographic purpose to aid in crystallization and solubility improvement. In parrel, we determined the structural and functional mechanism of Osh1, which can be to exploited to understand the structure and function of human homologs.
( 출처 : SUMMARY 5p )
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 목차 ... 2
- 연구계획 요약문 ... 3
- 연구결과 요약문 ... 4
- 한글요약문 ... 4
- SUMMARY ... 5
- 연구내용 및 결과 ... 6
- 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
- 2. 국내외 기술개발 현황 ... 7
- 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 8
- 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 13
- 5. 연구결과의 활용계획 ... 15
- 6. 연구과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ... 16
- 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 17
- 8. 참고문헌 ... 17
- 9. 연구성과 ... 18
- 10. 국가과학기술지식정보서비스에 등록한 연구시설‧장비 현황 ... 19
- 11. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 19
- 12. 기타사항 ... 19
- 별첨1. 대 표 연 구 성 과 ... 20
- 별첨2. 세부 목표 관련 증빙 ... 29
- 끝페이지 ... 29
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