초록 ▼

연구의 목적 및 내용
진핵 세포의 단백질의 폴딩과 구조적 안정성에 관여하는 이황 결합의 형성은 세포 활동에 필수적임. 본 과제는 산소를 전자 수용체로 사용하여 이황 결합을 형성하는 일련의 효소 작용이 산소가 적거나 없는 환경에서는 어떻게 조절되는지 밝히는 것을 주요 목표로 함. 또한 본 연구 결과를 바탕으로 저산소 환경에서도 증식하는 암세포나 병원균에 특이적인 저해제를 개발하고자 함.
1.진핵 세포 모델인 효모를 이용하여 혐기성 환경에서 이황 결합 형성 효소들의 작용 기작을 밝힘.
- 관련된 효소 탐색 및 효소학적,

연구의 목적 및 내용
진핵 세포의 단백질의 폴딩과 구조적 안정성에 관여하는 이황 결합의 형성은 세포 활동에 필수적임. 본 과제는 산소를 전자 수용체로 사용하여 이황 결합을 형성하는 일련의 효소 작용이 산소가 적거나 없는 환경에서는 어떻게 조절되는지 밝히는 것을 주요 목표로 함. 또한 본 연구 결과를 바탕으로 저산소 환경에서도 증식하는 암세포나 병원균에 특이적인 저해제를 개발하고자 함.
1.진핵 세포 모델인 효모를 이용하여 혐기성 환경에서 이황 결합 형성 효소들의 작용 기작을 밝힘.
- 관련된 효소 탐색 및 효소학적, 구조적, 기능적 특성 분석.
- 산소를 대체하는 전자 전달 체계 및 분자 기작을 밝힘
2.저산소 환경에서 작동하는 동물 세포의 단백질 이황 결합 시스템 확인.
- 효모에서 발견된 기작을 바탕으로 저산소 환경에서 이황결합 형성에 관여하는 효소 및 전자 수용체 확인.
- 효모와 동물 세포에서의 단백질 이황 결합 기작 비교 분석.
3.저산소 환경에서 단백질 이황 결합 형성을 유도하는 효소 기작에 대한 저해제 개발.
- In vitro기법으로 high throughput screening 방법 개발.
- 화합물 라이브러리로부터 저해제 탐색.
- 항암 물질 혹은 항생제로 응용

연구결과
1. 진핵세포 모델인 효모를 이용하여 혐기성 환경에서 이황 결합 형성 효소들의 작용 기작을 밝힘
- Osm1 단백질의 구조 및 기능 분석을 위해 안정한 단백질을 다량 확보 및 결정화 조건을 확립.
- 효모 유래의 soluble fumarate reductase의 3차 구조 규명.
- 구조적 유사성 분석과 변이체 연구를 통해 fumarate reduction 기작을 박테리아 유래 단백질과 비교 분석.
- 혐기성 조건에서 fumarate reductase 효소 활성 분석법을 확립을 통한 Osm1기능 분석.
- 진핵세포 유래 soluble fumarate reductase (Osm1) 구조의 PDB 등록 및 국내 특허 출원.
- 구조 연구를 통한 Osm1의 세포내 FAD, FMN, Riboflavin 산화의 새로운 기작 발견.
- Ero1과 Osm1의 직접 결합 확인 및 그 결합 부위 확인.
- In vitro 시스템에서 Osm-Ero1에 의한 혐기성 환경에서의 이황 결합 형성을 확인.
- 혐기성 환경의 이황결합 형성에 관여하는 Osm1의 ER내 retention 기작을 예측.
2. 저산소 환경에서 작동하는 동물세포의 단백질 이황 결합 시스템 확인
- 저산소에서 이황결합 형성에 관여하는 soluble fumarate reductase의 아미노산 서열 특징을 바탕으로 혐기성 환경에서 살아가는 nematode들에서 Osm1-like 단백질들을 발견.
- C.elegance의 Osm1-like 단백질인 c.e.FR1의 ER retention에 필요한 서열 확인.
- c.eFR과 재선충 Osm1-like 단백질의 발현을 위한 construct 제작 및 단백질 확보 및 효소 활성, 저산소 환경에서의 Ero1에 작용하여 이황결합 형성을 확인.
- c.e.FR1의 다양한 결정 확보 및 3차 구조 구명 및 Osm1과의 구조적 차이, 유사점을 확인.
3. 저산소 환경에서 단백질 이황 결합 형성을 유도하는 효소기작에 대한 저해제 개발
- 저해제 발굴에 필요한 soluble fumarate reductase의 저산소 환경에서의 활성 분석, 이황결합 형성 분석 시스템, high throughput screening system 확보하고 국내 특허 출원.
- c.elegance FR1 구조를 바탕으로 기질 FAD가 결합하는 신규 부위를 표적 pocket으로 하여, 가상 검색을 진행하여 35개의 inhibitor 후보들을 확보.
- 효소 활성 분석 및 Surface plasmon resonance를 활용한 결합 분석을 통해 저해제 탐색.
- c.e.FR1에 특이적인 저해 물질 2개 확보.

연구결과의 활용계획
1. 학문적 기대효과 및 활용
- 저산소 환경에서 동물 세포의 소포체내 단백질 산화, 지질 생합성 등에 필요한 전자 전달체계는 그 중요성에도 불구하고 지금까지 거의 연구되지 않은 분야이며, 전 세계적으로 저산소 환경에서의 이황결합 형성기작 연구를 진행하는 연구팀이 거의 없어, 본 연구 결과는 이 분야의 대표적 연구 결과가 될 것임.
- 저산소 환경에서의 이황결합 형성 기작은 세포 생물학적, 생화학적으로 중요한 발견으로 학문적 가치가 높음.
2. 의약, 산업적 기대 효과
- 저산소 환경에서도 활발히 증식하는 암세포의 이황 결합 형성에 대한 생화학적, 구조 생물학적 이해는 저산소에서 서식하는 암세포, 기생충 (재선충, 사상충 등), 진균 등에 대해 선택적으로 작동하는 저해제 개발로 발전시킬 수 있음.
- 특히 국내에 유입된 소나무 재선충의 경우 특별한 치료제가 없는 상황이기 때문에, 재선충에 특이적인 치료제 개발은 국내 뿐 아니라 국외 소나무 산림 병제에 큰 효과를 나타낼 수 있음.
- 정확한 이황결합 형성은 대부분의 단백질 의약품 생산에 있어서 중요한 문제이기 때문에, 산화적 단백질 폴딩에 관여하는 효소들에 대한 연구는 단백질 산업이나 단백질 의약품 생산을 위한 세포 공학에 활용 가능.

( 출처 : 한글요약문 5p )

Abstract ▼

Purpose&contents
Disulfide bond formation is a critical cellular process for oxidative protein folding of secretory proteins in eukaryotes. Here, we found and characterize the enzymatic system for disulfide bond under anaerobiosis or hypoxia. Based on results, we could identify small molecules to

Purpose&contents
Disulfide bond formation is a critical cellular process for oxidative protein folding of secretory proteins in eukaryotes. Here, we found and characterize the enzymatic system for disulfide bond under anaerobiosis or hypoxia. Based on results, we could identify small molecules to inhibit key enzyme, soluble fumarate reductase, for anaerobic disulfide bond formation or recycle of cellular flavin molecules.
1. Elucidate the molecular mechanism for disulfide bond formation by the enzymatic machinery in the yeast ER under anaerobic condition.
2 Determine high resolution structures, catalytic mechanism, and cellular functions of Osm1-like proteins in c.elegance, Bursaphelenchus xylophilus, Brugia malai and other parasites
3. Develop specific inhibitors for soluble fumarate reductases from parasites.

Result
1. Elucidate the molecular mechanism for disulfide bond formation by the enzymatic machinery in the yeast ER under anaerobic condition.
- Establish protein preparation and crystallization condition for Osm1 crystal structure determination.
- Determine Osm1 crystal structure.
- Compare Osm1 structure to that of soluble fumarate reductase from bacteria.
- Analyze catalytic activity of soluble fumarate reductase under anaerobic condition.
- Find novel molecular mechanism of eukaryotic soluble fumarate reductase to oxidize cellular flavins.
- Determine molecular mechanism for anaerobic disulfide formation by interaction between Osm1 and Ero1.
- Elucidate ER retention mechanism of Osm1 in the cell.
2. Determine high resolution structures, catalytic mechanism, and cellular functions of Osm1-like proteins in c.elegance, Bursaphelenchus xylophilus, Brugia malai and other parasites
- Identify Osm1-like protein in multi-cellular organism, like nematodes, that can survive under hypoxia or anaerobic condition, based on properties of Osm1 primary sequence.
- Characterize c.e.FR1 primary sequence, such as ER retention seqeunce.
- Construct plasmids for c.eFR1 and B. xylophilus Osm1-like protein expression and preparation.
- Characterize c.e.FR1 by determining catalytic activity for disulfide bond formation and crystal structures.
3. Develop specific inhibitors for soluble fumarate reductases from parasites.
- Establish enzyme assay system for high throughput inhibitor screening against soluble fumarate reductase originated from yeast or c.elegance.
- Provide primary screened small molecules to inhibit c.e.FR1 by using virtual screening.
- Identify c.eFR1 inhibitors showing efficacy through the catalytic assay system.

Expected Contribution
1. Academic contribution
- Despite of importance of redox reactions in eukayotic cells, such as protein oxidation and lipid oxidation, under anaerobic condition, it has not been studied well. This study will lead the field of anaerobic redox reaction over the world.
- This study discovered invaluable information for anaerobic disulfide bond formation to the Cell and biochemistry.
2. Applications to industry
- This study provides novel drug target system specific to fungy and nematodes, which can survive under low oxygen level.
- Based on this study, specific antibiotics against fungi and nematodes could be developed. Especially, B. xylophilus has caused serious problem in Japan and Korean by infecting pine trees. Soluble fumarate reductase can be very specific drug target for B. xylophilus.
- Correct disulfide bond formation is critical for synthesis of secretory proteins, including many biopharmaceutics, such as antibodies and growth factors. This study can provide invaluable information for cell and protein engineering for biopharmaceutics.

( 출처 : SUMMARY 6p )

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 3
• 연구 계획 요약문 ... 4
• 연구 결과 요약문 ... 5
• 한글요약문 ... 5
• SUMMARY ... 6
• 연구내용 및 결과 ... 7
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 7
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 8
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 9
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 22
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 24
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 26
• 7. 주관연구책임자 대표적 연구 실적 ... 26
• 8. 참고 문헌 ... 26
• 9. 연구성과 ... 27
• 10. 국가과학기술지식정보서비스에 등록한 연구시설‧장비 현황 ... 28
• 11. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 28
• 12. 기타사항 ... 28
• 별첨1. 대표적 연구실적 요약문 ... 29
• 별첨2. 달성가능성이 제시될 수 있는 증빙 ... 34
• 별첨3. 대표적 연구실적 사본 ... 40
• 끝페이지 ... 50