[보고서]홍역 및 유행성이하선염 재조합바이러스 제작

정용태

[국가R&D연구보고서] 홍역 및 유행성이하선염 재조합바이러스 제작
Construction of reverse genetics system for measles and mumps viruses 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	단국대학교 DanKook University
연구책임자	정용태
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2015-12
과제시작연도	2015
주관부처	보건복지부 [Ministry of Health & Welfare(MW)(MW)
연구관리전문기관	질병관리본부 Korea Center for Diease Control and Prevention
등록번호	TRKO201800038006
과제고유번호	1465019544
사업명	감염병관리기술개발연구
DB 구축일자	2018-09-15
키워드	홍역.유행성이하선염.역유전학법.백신.항바이러스제.measles.mumps.reverse-genetics.vaccine.antivirals.
DOI	https://doi.org/10.23000/TRKO201800038006

초록 ▼

○ 연구목표 및 필요성
- 국내에서 분리된 홍역과 유행성이하선염 바이러스에 대한 역유전학법 구축을 위해 8종의 역유전학법용 플라스미드(각 바이러스별 전장유전자 1종, helper plasmid 3종)를 제작하는 것이 본 연구의 목표임.

- 2006년의 홍역퇴치선언에도 불구하고, 지난 2013년부터 해외유입으로 인한 국내 홍역 환자가 급격히 증가하고 있음. 유행성이하선염은 주요 학교 감염병 중의 하나로 2013년을 기점으로 그 발생이 계속 증가하고 있어 보건당국이 예의주시하고 있는 상황임.

- 이러한 상황으로 미루어 볼 때, 홍역과 유행성이하선염 바이러스의 국내 유행에 대한 대비책의 마련이 시급함. 따라서, 홍역과 유행성이하선염 바이러스에 대한 치료제와 백신을 개발하기 위한 역유전학법을 구축 연구의 필요성이 매우 높은 상황임.

○ 연구내용
- 바이러스의 전장유전자가 삽입된 T7 프로모터 기반의 역유전학법용 플라스미드의 구축

- 바이러스의 음성가닥 RNA 전사를 위한 N, P, 그리고 L 단백질발현 helper plasmid의 제작

○ 연구결과
- 홍역 바이러스의 전장유전자가 삽입된 T7 프로모터 기반의 역유전학법용 플라스미드의 구축 완료

- 홍역 바이러스의 음성가닥 RNA 전사를 위한 N, P, 그리고 L 단백질발현 helper plasmid의 제작완료 및 단백질 발현 확인 완료

- 유행성이하선염 바이러스의 전장유전자가 삽입된 T7 프로모터 기반의 역유전학법용 플라스미드의 구축 완료

- 유행성이하선염 바이러스의 음성가닥 RNA 전사를 위한 N, P, 그리고 L 단백질발현 helper plasmid의 제작완료

○ 기대성과 및 활용방안
- 홍역 및 유행성이하선염 바이러스 국내분리주에 대한 역유전학법용 플라스미드를 이용하면 녹색형광단백질(GFP)와 같은 리포터 단백질을 발현하는 바이러스를 제작하여 치료제 및 백신 개발에 활용할 수 있음.

(출처 : 연구결과점검보고서 요약문 5p)

Abstract ▼

○ Purpose of the Research
- Measles and mumps incidences in South Korea have inclined over the last few years mainly by imported viruses. Thus, there is an urgent need to develop vaccines and therapeutics against Korean isolates.

- Development of reveres-genetics systems provide a powerful tool for the not only fundamental virus research on the viral life cycle, pathogenicity, and transmission mechanism but also vaccine and therapeutic research.

○ Scope and Contents
- Construction of full-length plasmid for reverse genetics system of measles virus Korean H1 strain.
- Construction and identification of helper plasmids for reverse genetics system of measles virus Korean H1 strain.
- Construction of full-length plasmid for reverse genetics system of mumps virus Korean I strain.
- Construction and identification of helper plasmids for reverse genetics system of mumps virus Korean I strain.

○ Results of the Research
- The full-length plasmids for reverse genetics system of measles and mumps viruses are successfully constructed, respectively.
- The helper plasmids for reverse genetics system of measles and mumps viruses are successfully constructed, respectively.

○ Application of the Research Findings
- These research findings can be applied for the generation of GFP-expressing measles and/or mumps viruses. Using GFP-expressing viruses, high-throughput screening systems can be established for the drug development against measles and mumps viruses.

(출처 : Summary 6p)

목차 Contents

표지 ... 1
학술연구개발용역과제 최종결과보고서 ... 2
목차 ... 3
연구결과점검보고서 요약문 ... 5
Summary ... 6
학술연구개발용역과제 연구결과 ... 7
제1장 최종 목표 ... 7
제2장 국내외 기술 현황 ... 19
제3장 최종 연구 내용 및 방법 ... 23
제4장 최종 연구 결과 ... 92
제5장 연구결과 고찰 및 결론 ... 93
제6장 연구성과 및 활용계획 ... 96
제7장 연구용역과제 진행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 98
제8장 기타 중요변경사항 ... 98
제10장 참고문헌 ... 99
제11장 첨부서류 ... 99
제1세부용역과제 연구결과 ... 100
제1장 최종 목표 ... 100
제2장 국내외 기술 현황 ... 107
제3장 최종 연구 내용 및 방법 ... 110
제4장 최종 연구 결과 ... 150
제5장 연구결과 고찰 및 결론 ... 150
제6장 연구성과 및 활용계획 ... 152
제7장 연구용역과제 진행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 154
제8장 기타 중요변경사항 ... 154
제10장 참고문헌 ... 155
제11장 첨부서류 ... 155
제2세부용역과제 연구결과 ... 156
제1장 최종 목표 ... 156
제2장 국내외 기술 현황 ... 162
제3장 최종 연구 내용 및 방법 ... 164
제4장 최종 연구 결과 ... 196
제5장 연구결과 고찰 및 결론 ... 196
제6장 연구성과 및 활용계획 ... 198
제7장 연구용역과제 진행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 200
제8장 기타 중요변경사항 ... 200
제10장 참고문헌 ... 201
제11장 첨부서류 ... 201
끝페이지 ... 201

표/그림 (145)

표 홍역 바이러스의 유전자 구조의 모식도
표 홍역 바이러스의 역유전학법의 모식도
표 최근 5년간 학교감염병 발생 순위
표 유행성이하선염의 연도별 발생 현황
표 유행성이하선염 바이러스의 유전자 구조의 모식도
표 유행성이하선염 바이러스의 역유전학법의 모식도
표 Paramyxovoridae 의 역유전학법 모식도
표 pSL1180 vector map 및 multiple cloning site(MCS)
표 홍역 전장 유전자를 얻기 위한 프라이머 디자인 모식도
표 홍역 전장 유전자를 얻기 위한 프라이머 제작
표 Genetic marker로 도입한 FseI 제한효소 자리의 모식도
표 홍역 전장 유전자의 Fragment 1, 2, 5, 6, 그리고 7 의 PCR 결과
표 Overlap PCR 을 통한 Fragment 1+2, Fragment 5+6 확보
표 Fragment 8 합성에 대한 모식도
표 Overlap PCR을 통하여 Fragment 8 확보
표 홍역 Fragment 1 의 유전자 분석 결과
표 홍역 Fragment 2 의 유전자 분석 결과
표 홍역 Fragment 5 의 유전자 분석 결과
표 홍역 Fragment 6 의 유전자 분석 결과
표 홍역 Fragment 7 의 유전자 분석 결과
표 홍역 Fragment 1+2 의 유전자 분석 결과
표 Fragment 3 과 fragment 4 유전자 합성 보고서
표 Fragment 8-2 의 합성결과
표 홍역 Fragment 8 의 유전자 분석 결과
표 Fragment 3+4와 7+8의 확보
표 제한효소 처리를 통하여 fragment 7+8의 삽입여부를 확인
표 제한효소 처리를 통하여 fragment 1+2의 삽입여부를 확인
표 제한효소 처리를 통하여 fragment 3+4+5+6의 제작 및 삽입여부를 확인
표 제한효소 처리를 통하여 1) pSL1180(1278)을 linearization 하고 2) fragment 3+4+5+6을 확보
표 제한효소 처리를 통해 홍역 바이러스의 전장유전자가 pSL1180에 삽입되어 있는 패턴을 확인
표 인위적으로 도입시킨 제한효소 처리를 통해 홍역 바이러스의 전장유전자가 pSL1180에 삽입되어 있음을 확인
표 유전자 염기서열 분석 및 alignment 결과
표 Polymerase gene을 발현시키기 위한 pTM1 vector
표 pTM vector 내에 삽입 할 measles N, P, L 유전자 모식도
표 N, P, L 유전자를 확보하기 위한 pTM vector용 프라이머
표 pTM vector 에 삽입하기 위한 N, P, L 유전자에 대한 PCR
표 L gene을 확보하기 위한 overlap PCR 결과
표 pTM vector 내에 삽입된 N, P, L 유전자 확인을 위하여 enzyme 처리
표 pTM vector 에 삽입된 홍역 N 유전자의 염기서열
표 pTM vector 에 삽입된 홍역 P 유전자의 염기서열
표 단백질 발현 확인을 위한 홍역 mini-genome system의 모식도
표 Mini-genome system을 이용한 helper 플라스미드의 단백질 발현 및 기능 확인
표 유행성이하선염 전장 유전자 확보를 위한 프라이머
표 유행성이하선염 전장 유전자를 얻기 위한 프라이머 모식도
표 3개의 변이로 새롭게 도입된 FseI 제한효소 부위
표 유행성이하선염 전장 유전자를 얻기 위한 Fragment 1, 2+3, 4, 5, 6 의 PCR 산물
표 Fragment 7 의 PCR 산물
표 유행성이하선염 Fragment 1 의 유전자 분석 결과
표 유행성이하선염 Fragment 2+3 의 유전자 분석 결과
표 유행성이하선염 Fragment 2+3 의 유전자 분석 결과
표 유행성이하선염 Fragment 4 의 유전자 분석 결과
표 유행성이하선염 Fragment 5 의 유전자 분석 결과
표 유행성이하선염 Fragment 6 의 유전자 분석 결과
표 유행성이하선염 Fragment 7 의 유전자 분석 결과
표 유행성이하선염 Fragment 8-2 의 유전자 합성 의뢰
표 Fragment 8 합성의 모식도
표 Overlap PCR을 통한 Fragment 8 합성 결과
표 유행성이하선염 Fragment 8 의 유전자 분석 결과
표 Fragment 1+2, 3+4, 5+6, 그리고 7+8이 삽입된 플라스미드의 제작
표 Fragment 1+2+3+4와 5+6+7+8이 삽입된 플라스미드의 제작
표 Ligation을 통한 fragment 1+2+3+4+5+6+7+8의 제작
표 Fragment 1+2+3+4+5+6+7+8이 삽입된 역유전학법용 플라스미드의 제작
표 pTM vector 에 삽입하기 위한 NP, P, 그리고 L 유전자 합성용 프라이머 제작
표 유행선이하선염 바이러스의 RNA를 주형으로 RT-PCR을 수행 한 결과
표 L 유전자를 확보하기 위한 overlap PCR 진행 결과
표 pTM 플라스미드 구축 확인을 위한 제한효소 처리 결과
표 pTM vector에 삽입된 유행성이하선염 바이러스 NP 유전자의 염기서열 분석 결과
표 pTM vector에 삽입된 유행성이하선염 바이러스 P 유전자의 염기서열 분석 결과
표 RNA editing을 통한 유행성이하선염 바이러스 P 단백질의 발현
표 RNA editing 된 염기서열을 갖는 pTM-P 플라스미드의 제작
표 pTM vector 에 삽입된 홍역 L 유전자의 염기서열
표 유행성이하선염 바이러스에 대한 mini-genome system의 모식도
표 국내 홍역 환자 발생 현황
표 미국의 홍역 환자 발생 현황
표 홍역 바이러스의 유전자 구조의 모식도
표 홍역 바이러스의 역유전학법의 모식도
표 Paramyxovoridae 의 역유전학법 모식도
표 pSL1180 vector map 및 multiple cloning site(MCS)
표 홍역 전장 유전자를 얻기 위한 프라이머 디자인 모식도
표 홍역 전장 유전자를 얻기 위한 프라이머 제작
표 Genetic marker로 도입한 FseI 제한효소 자리의 모식도
표 홍역 전장 유전자의 Fragment 1, 2, 5, 6, 그리고 7 의 PCR 결과
표 Overlap PCR 을 통한 Fragment 1+2, Fragment 5+6 확보
표 Fragment 8 합성에 대한 모식도
표 Overlap PCR을 통하여 Fragment 8 확보
표 홍역 Fragment 1 의 유전자 분석 결과
표 홍역 Fragment 2 의 유전자 분석 결과
표 홍역 Fragment 5 의 유전자 분석 결과
표 홍역 Fragment 6 의 유전자 분석 결과
표 홍역 Fragment 7 의 유전자 분석 결과
표 홍역 Fragment 1+2 의 유전자 분석 결과
표 홍역 Fragment 5+6 의 유전자 분석 결과
표 홍역 Fragment 5+6 의 유전자 분석 결과
표 Fragment 3 과 fragment 4 유전자 합성 보고서
표 Fragment 8-2 의 합성결과
표 홍역 Fragment 8 의 유전자 분석 결과
표 Fragment 3+4와 7+8의 확보
표 제한효소 처리를 통하여 fragment 7+8의 삽입여부를 확인
표 제한효소 처리를 통하여 fragment 1+2의 삽입여부를 확인
표 제한효소 처리를 통하여 fragment 3+4+5+6의 제작 및 삽입여부를 확인
표 제한효소 처리를 통하여 1) pSL1180(1278)을 linearization 하고 2) fragment 3+4+5+6을 확보
표 제한효소 처리를 통해 홍역 바이러스의 전장유전자가 pSL1180에 삽입되어 있는 패턴을 확인
표 인위적으로 도입시킨 제한효소 처리를 통해 홍역 바이러스의 전장유전자가 pSL1180에 삽입되어 있음을 확인
표 유전자 염기서열 분석 및 alignment 결과
표 Polymerase gene을 발현시키기 위한 pTM1 vector
표 pTM vector 내에 삽입 할 measles N, P, L 유전자 모식도
표 N, P, L 유전자를 확보하기 위한 pTM vector용 프라이머
표 pTM vector 에 삽입하기 위한 N, P, L 유전자에 대한 PCR 결과
표 L gene을 확보하기 위한 overlap PCR 결과
표 pTM vector 내에 삽입된 N, P, L 유전자 확인을 위하여 enzyme 처리
표 pTM vector 에 삽입된 홍역 N 유전자의 염기서열
표 pTM vector 에 삽입된 홍역 P 유전자의 염기서열
표 단백질 발현 확인을 위한 홍역 mini-genome system의 모식도
표 Mini-genome system을 이용한 helper 플라스미드의 단백질 발현 및 기능 확인
표 유행성이하선염 바이러스의 유전자 구조의 모식도
표 유행성이하선염 바이러스의 역유전학법의 모식도
표 Paramyxovoridae 의 역유전학법 모식도
표 유행성이하선염 전장 유전자 확보를 위한 프라이머
표 유행성이하선염 전장 유전자를 얻기 위한 프라이머 모식도
표 3개의 변이로 새롭게 도입된 FseI 제한효소 부위
표 유행성이하선염 전장 유전자를 얻기 위한 Fragment 1, 2+3, 4, 5, 6 의 PCR 산물
표 Fragment 7 의 PCR 산물
표 유행성이하선염 Fragment 1 의 유전자 분석 결과
표 유행성이하선염 Fragment 4 의 유전자 분석 결과
표 유행성이하선염 Fragment 5 의 유전자 분석 결과
표 유행성이하선염 Fragment 6 의 유전자 분석 결과
표 유행성이하선염 Fragment 7 의 유전자 분석 결과
표 유행성이하선염 Fragment 8-2 의 유전자 합성 의뢰
표 Fragment 8 합성의 모식도
표 Overlap PCR을 통한 Fragment 8 합성 결과
표 유행성이하선염 Fragment 8 의 유전자 분석 결과
표 Fragment 1+2, 3+4, 5+6, 그리고 7+8이 삽입된 플라스미드의 제작
표 Fragment 1+2+3+4와 5+6+7+8이 삽입된 플라스미드의 제작
표 Ligation을 통한 fragment 1+2+3+4+5+6+7+8의 제작
표 Fragment 1+2+3+4+5+6+7+8이 삽입된 역유전학법용 플라스미드의 제작
표 pTM vector 에 삽입하기 위한 NP, P, 그리고 L 유전자 합성용 프라이머 제작
표 유행선이하선염 바이러스의 RNA를 주형으로 RT-PCR을 수행 한 결과
표 L 유전자를 확보하기 위한 overlap PCR 진행 결과
표 pTM 플라스미드 구축 확인을 위한 제한효소 처리 결과
표 pTM vector에 삽입된 유행성이하선염 바이러스 NP 유전자의 염기서열 분석 결과
표 pTM vector에 삽입된 유행성이하선염 바이러스 P 유전자의 염기서열 분석 결과
표 RNA editing을 통한 유행성이하선염 바이러스 P 단백질의 발현
표 RNA editing 된 염기서열을 갖는 pTM-P 플라스미드의 제작
표 pTM vector 에 삽입된 홍역 L 유전자의 염기서열
표 유행성이하선염 바이러스에 대한 mini-genome system의 모식도

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