보고서 정보
주관연구기관 |
농림축산검역본부 Animal and Plant Quarantine Agency |
연구책임자 |
구복경
|
참여연구자 |
유소윤
,
나진주
,
사공민근
,
신문균
,
변재원
,
위성환
,
정광면
,
김준배
,
김정화
,
김춘희
,
이혜영
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2017-12 |
과제시작연도 |
2017 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 |
TRKO201800042106 |
과제고유번호 |
1545014835 |
사업명 |
농림축산검역검사기술개발 |
DB 구축일자 |
2018-10-20
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키워드 |
FMDV O.A and Asia 1.Lateral flow strip kit.
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201800042106 |
초록
▼
◦세부과제명: 구제역 혈청형 (O, A, Asia1) 3종 감별 간이 항원진단킷트 개발(1년차)
< FMDV O type >
1.(면역원 및 MoAb) Peptide(2), FMDV vaccine(1) 및 불활화 항원(2) 총 5개 면역원 이용 FMDV O형 특이적인 고역가 18종 단클론항체를 제작하였으며 또한 Antibody pairing test (Capture antibody & Conjugate antibody)를 통해 O형에 특이적인 최종의 9종의 pair 선별하였음
2. (최종 Pair MoAb
◦세부과제명: 구제역 혈청형 (O, A, Asia1) 3종 감별 간이 항원진단킷트 개발(1년차)
< FMDV O type >
1.(면역원 및 MoAb) Peptide(2), FMDV vaccine(1) 및 불활화 항원(2) 총 5개 면역원 이용 FMDV O형 특이적인 고역가 18종 단클론항체를 제작하였으며 또한 Antibody pairing test (Capture antibody & Conjugate antibody)를 통해 O형에 특이적인 최종의 9종의 pair 선별하였음
2. (최종 Pair MoAb선정) FMDVO type 8개 지역형(Topotype) 중 우리나라 유입 가능성 높은 4개의 지역형(ME-SA, SEA, EURO-SA, CATHAY) 바이러스 12종에서의 최저검출 한계 결과 9종의 pair 모두 높은 반응성을 보였고 현재 방역현장에서 사용하는 항원 키트 (PBM사)보다 10〜100배 더 민감하였음. 이중 Capture 항체와 Conjugate 항체고 민감도와 특이를 나타내는 최종Pair 1종(Capture4B14 및 Conjugate 7F32)의 Clone 으로 이루어진 FMDV O serotype 8번 pair를 선발하였음
3. (기존항원진단법과 비교)선발된 rapid kit(QIA)에 대한 기존항원 진단법과의 비교결과(O1manisa 바이러스이용) rRT-PCR 102, 항원ELISA 104, Rapid-kit (QIA) 104인 반면 PBMKit 105을 나타내어 민감도는 세계표준연구소 항원 ELISA와는 같고 PBM 에는 10배이상 높았음.
< FMDV A type >
4. (면역원 및 MoAb) A22 Iraq항원 뱅크 및 불활화항원 2개를 면역원으로 하여 A형구제역 바이러스에 특이적인 고역가 14종의 단클론항체를 제작한후 Antibody pairing test통해 2종의 pair 선별
5. (최종 Pair MoAb선정) 1(6E82/1H77), 2(6E82/3H28) pair를 최종적으로 선정하기위해 A형4주(표준3, 분리1)이용 민감도 조사, 22개 주 이용 특이성 조사(O형15주(표준6, 분리8) Asia 1형 3주(표준1, 분리2), C, SAT1,2,3 각각 하나 표준균주사용 총22균주)에 모두 우수한 No. 2 pair를 최종적으로 선정하였음
6. (기존항원 진단법과 비교) 선발된 A rapid kit(QIA)에 대한 기존항원 진단법과의 비교결과 (A Iraq 바이러스이용) rRT-PCR 102, 항원ELISA 104, Rapid-kit (QIA) 104인 반면 PBMKit 106을 나타내어 민감도는 세계표준연구소 항원 ELISA와는 같고 PBM 에는 100배 이상 높았음.
< FMDV Asia1 type >
7.(면역원 및 MoAb) Asial 1 shamir 불활화 1종을 면역원으로 하여 Asial 1형 구제역 바이러스에 특이적인 고역가 13종의 단클론항체를 제작한 후 Antibody pairing test통해 5종의 pair 선별
8.(최종 Pair MoAb선정) FMDV Serotype Asia1 3균주(Shamir, Cambodia 9/80, ongolia/05) 단계 희석액을 통해 Pair 1, 2, 3의 민감성이 4, 5번 Pair 보다 높게 나타나 Pair 1, 2, 3이 우수한 것으로 나타나 1(6E82/1H77), 2(6E82/3H28) pair를 최종적으로 선정하였음
9. (기존항원진단법과 비교)선발된 3종류 pair set Asia 1 rapid kit(QIA) 대한 기존항원 진단법과의 비교결과(Asia 1 shamir 바이러스이용) rRT-PCR 102, 항원ELISA 104±, 1,2,3,Rapid-kit (QIA)는 104수준인 반면 PBM Kit 106을 나타내어 PBM Kit 보다 100배 세계준연구소 항원 ELISA와 같은 민감도 보여 우수한 것으로 판명됨
o 세부과제명: 구제역 바이러스 혈청형 3종 감별진단킷트 시제품 생산 및 현장적용 실험 (2년차)
< FMDV O type >
1. (바이러스 접종돼지 타액내 검출한계 비교) O 형구제역 바이러스로 공격접종된 3마리 돼지타액에 대해 기존의 항원 진단법과 Rapid kit(QIA, PBM)로 항원 검출 비교 결과 rRT-PCR는 모두 양성(3), 항원ELISA는 1마리, Rapid-kit (PBM)는 모두 음성이였으나 Rapid-kit (QIA)에서는 2마리 양성으로 PBM kit와 세계표준연구소 항원ELISA보다도 민감도가 높았으며, 수포 뿐만 아니라 타액에서의 구제역 항원 검출 민감도 확인됨.
2. (2017년 충북보은 및 전북정읍 구제역 발생축적용) FMDO rapid kit(QIA)룰 2017년 구제역발생축 타액 4점이용 기존의 항원진단법과 비교결과 rRT-PCR(4/4), Ag ELISA(3/4), QIARapid kit(4/4), 스웨덴PANFMDVrapid kit SVANODIP(2/4), PAN FMDV rapid kit PBM(0/4)였으며, 타액9점에서는 SVANODIP(6/9), PBM(0/9), QIA kit(9/9)의 결과를 나타내어 QIA Rapid kit가 아주 우수한 것으로 판명
(※ 17년 연천 발생 FMDVA 발생시 감역축 타액에서는 음성을 나타내었음)
3. (베트남에서 구제역 발생축 샘플적용) FMDO rapid kit(QIA)룰 베트남 구제역 발생축 20 샘플에 적용한 결과 세계표준연구소 항원 엘라이자에서 11개가 FMDV O로 판명, 이 중 10개 샘플이 FMDV O Rapid kit(QIA)에서 양성을 보임. 그리고, NT 샘플 7개 중 4개가 FMDV O로 판명나 엘라이자보다 상대적으로 아주 저렴한 Rapid kit 가 개발도상국에서의 활용도가 높을 것으로 여겨짐
4.(태국에서 구제역 발생 축 샘플 적용) ① PCR 12샘플 양성/항원 엘라이자 모두 음성/Rapid kit 3샘플 양성을 보여 항원함유가 미약한 샘플의 경우 유전자검사에서는 양성을 보였으나 항원 엘라이자에서 음성을 나타낸 3샘플이 Rapid kit 에는 양성으로 확인됨 ② PCR 12샘플 양성/항원엘라이자 모두 양성을 나타낸 샘플 Rapid kit 에서도 모두 양성을 보임
5. (미얀마에서 구제역 발생축 샘플 적용)유전자진단으로 FMD O로 판명난 10샘플결과 PBM kit 에서는 6개 양성 Rapid kit 에서는 8개 양성이 관찰됨(이중 항원엘라이자에서는 10샘플 모두 양성으로 관찰되었으나 이중 3개 샘플은 모두 항원농도가 낮은 것으로 판명, 1개는 cut off 0.1수준, 2개는 0.2 수준)
< FMDV A type >
6.. (2017년 연천구제역 발생축적용) 17년2.8일 연천젖소에서 발생한 FMDVA에 감염된 젖소타액 5점에 대해 기존의 항원진단법과 비교결과 rRT-PCR(5/5), Ag ELISA(2/5), QIA Rapid kit(2/5), SVANODIP rapid kit(1/5), PBM rapid kit(0/5) 결과를 보여 A형 Rapid-kit (QIA)는 O형 rapid kit와 마찬가지로 민감도가 OIE 표준 항원 ELISA kit수준과 PBM, SVANODIP Rapid kit 보다는 훨씬 더 민감하였음
7.(살처분 농가적용) 17년2월 충북보은 구제역O형에 감염된 농장주위 살처분 농가소 타액샘플 (rRT-PCR모두음성)을 A형rapid kit(QIA) 적용결과 63검체 모두 음성을 나타내었고, 17년 2월 구제역 발생 구제역 O형 감염축 타액 및 비즙(모두 rRT-PCR 양성) 28검체에 대해서도 28검체 타액 모두에서 음성을 나타내어 특이성이 우수함을 확인하였음
8. (미얀마에서 구제역 발생축 샘플 적용) 유전자진단으로 FMD A로 판명난 6샘플결과 PBM kit에서는 1개 양성 Rapid kit 에서는 2개 양성이 관찰됨(항원엘라이자에서 6샘플중 4개 양성이고 , 2개는 음성이였으며 양성샘플중 2개는 Cut off 0.1수준이였음)
< FMDV Asia1 type >
9. (미얀마에서 구제역발생축 샘플 적용): 2017년 1월에 발생한 FMDV Asia 1형 2두에 적용해본 결과 항원 엘라이자 2두 모두 양성, PBM kit 1두양성, Rapid kit 에서는 2두모두 양성을 보였고, ‘97년 발생 FMDV Asia 1 형 1두 실험결과 PBM 음성, 개발된 Rapid kit양성 확인하였음
‘05년에 발생한 FMDV Asia 1 에 대해서는 항원엘라이자에서 항원의 농도가 아주 높았으며, PBM kit에서도 양성을 나타내었지만 개발된 Rapid kit 에서는 음성을 나타내어 이에 대한 후속 연구 필요
< FMDV Common type >
10. (고역가 단클론항체 선발) 20종의 고역가 단클론항체 중 최종적으로 1, 3, 5, 9~12까지 총 7개의 클론선발선발하여총49가지pairing test를실시하여 FMDV O, A 와Asia 1에서강한 양성인 1, 2, 3, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 43, 44, 45 번 등 12개 클론 선발 후 FMDV C, SAT 1, 2, 3 에 가장 반응성이 우수한 1, 8, 9, 15, 16 5개의 Pair 선발됨. 이중 SAT2에 가장 반응성이 우수한 2-1(1E58/1E58)클론이 최종적으로 Common 항체로 선발되었음
< 시제품 생산 >
11. (Diagram) NC membrane위에 총 5개 line 이 있으며, 1st line은 control line, 그 다음 구제역 7개 혈청형 모두 검출가능한 Common line, 다음 순서대로 FMDVO,FMDVA, FMDV Asia 1을 특이적으로 검출가능한 3종류 line이 있음. 그리고, 샘플 60ul를 떨어뜨리는 샘플 패드에 구제역 Common line에 사용된 7가지 혈청형 모두 검출 가능한 클론을 동시에 Conjugation 항체로 사용하여 샘플패드에 결합된 형태로 생산.
12. (선발된 4종항체 특성) 최종적으로 선발된 항체 4종 FMDV O(7F32), FMDVA(3H28), FMDVAsia1(5D39), FMDV Common 및 Conjugation(1E58) 모두의 epitope이 리니어 폼이 아닌 Conformational 폼으로 확인, 높은 민감도가 에피토톱의 Conformational 폼을 형성과 관련 있는 것으로 여겨짐
13. (민감성 및 특이성확인)개발된 킷트에서 7종 혈청형 모두 잘 반응하고 주요 3가지 혈청형 FMDV O, A 그리고 Asia1은 감별 가능한 것을 알 수 있었을 뿐만아니라 구제역 외에 다른 수포성질병에는 반응하지 않아 특이성 확인되었으며, 개발된 5Line kit의 민감성은 Strain별로 약간의 차이는 있으나 주로 103~104 TCID50 민감성보임. 특히 PBM 킷트와의 비교에서는 주로 더 10배정도 더 민감함 확인됨
14. (다른킷트와의 비교)개발된 5Line kit 는 Svanodip 과 PBM kit 보다 민감성이 더 우수하였고, Ag ELISA(Pirbright)와는 동일한 결과를 보였으나, FMDV Asia 1 103 TCID50 경우 항원 엘라이자 음성, 5Line kit에서는 양성을 보임. 4~6시간 진단시간이 소요되는 항원 엘라이자 결과와 15분이내 진단이 가능한 Rapid kit 에서의 그 결과가 동일하거나 혹은 더 민감한 결과를 얻을 수 있어 현장에서 효과적으로 사용 가능
15. (다른 킷트와의 Visbility 비교) 진천주104TCID50 농도에서5Line Rapid kit에서는 뚜럿한 밴드 쉽게 관찰가능한 반면에, Svanodip kit에서는 밴드가 아주약하고 diffuse하게 나타나 결과판정이 어려울 정도였으며 PBM kit의 경우에는 아주 약하게 반응을 하였음
16. (야외 감염축 적용결과) 올해 발생한 FMDV O 및 FMDV A 에 감염된 동물 타액4샘플 이용 다른 진단법과 비교하여 민감도 조사한 결과 Svanodip kit에서는 2개양성이나 이중 한개는 반응이 미약하였음
그러나 Rapid kit 결과에서는 3개가 양성으로 판정이 났으며 PBM kit에서는 모두 음성이였음 또한 Ag ELISA결과에서 4개중 2개에서 양성을 보였고 이중 한 개의 샘플은 항원의 농도가 cut off 0.1 으로낮았지만 이샘플에 대해서도 Rapid kit 에서는 양성으로 판명
< Seneca Valley virus >
17. 구제역과 유사한 증상을 보이며 같은 Picornaviridae aphtovirus인 Seneca Valley virus 를 구제역 바이러스 혈청A, O, Asia l Rapid kit와 동시에 Seneca Valley virus 도감별 진단할 수 있도록 민감도와 특이성이높은MoAb생산을위해 순수하게정제된면역원을생산하여마우스에 3주간격으로 3회 접종한 후 고역가의 클론 20여종을 선발하여 마우스 복수 생산중에 있음
(출처 : 연구결과 요약 3p)
Abstract
▼
In Korea, there have been a total nine outbreaks of foot-and-mouth disease.
Despite the national efforts of control Foot and mouth disease, FMD has been occurred every year since 2014. For the first time, two serotypes(A and O)of FMD occurred simultaneously in 2017.
In case of two differen
In Korea, there have been a total nine outbreaks of foot-and-mouth disease.
Despite the national efforts of control Foot and mouth disease, FMD has been occurred every year since 2014. For the first time, two serotypes(A and O)of FMD occurred simultaneously in 2017.
In case of two different types of FMDV occurred simultaneously during the same period, rapid differentiate serotypes of FMDV at the site is very important for early prevention.
Thus, the development of a rapid and simple method for the serological(O, A and Asia 1) detection of FMDV in field is very effective.
In this study, a lateral flow strip kit was developed and validated to differentiate serotypes(O, A and Asia 1)of foot-and-mouth disease infected cattle and swine.
The strip for the detection of major 3 serotypes of FMDV was developed using a monoclonal antibody shown to be O, A, Asia 1 reactive to FMDV of each serotypes.
Cattle and swine saliva samples were collected to evaluate the characteristics of the strip in comparison with existing commercial Antigen ELISA kit and lateral flow strip kit.
The strip was shown to be a high specificity and sensitivity using animals negative saliva samples and infected samples including vesicle fluids, saliva.
This suggests that the strip kit is a very useful for rapidly differentiate FMDV serotypes in field diagnosis.
(출처 : 영문초록 65p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 농림축산검역검사기술개발 연구과제 최종결과보고서 Final Report (FR) ... 2
- Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 7
- 1. 연구배경 ... 7
- 2. 연구최종목표 ... 9
- 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 9
- Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 10
- 1. 재 료 ... 10
- 2. 연구전략 및 방법 ... 10
- Ⅲ. 연구결과 ... 11
- Ⅳ. 연구결과요약 ... 58
- Ⅴ. 고 찰 ... 63
- Ⅵ. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 64
- Ⅶ. 주요연구과제 변경사항 ... 64
- Ⅷ. 참고자료 ... 64
- IX. 영문초록 ... 65
- 끝페이지 ... 65
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