초록 ▼

5. 최종 연구결과 요약
1. 항체진단키트 유효성평가를 위한 혈청 패널 구축
- NSP 항체 진단 키트 유효성 평가를 위해 혈청패널(구제역 바이러스 감염 혈청, NSP항체 검출 야외농장 혈청, 백신접종축 혈청, 비백신음성혈청) 873점을 구축함.
- 국내 예찰용으로 사용중인 NSP ELISA 3종 키트(메디안, 바이오노트, 프리오체크), SP-O ELISA 및 VNT 등의 검사 수행하여 기초데이터 분석 완료하였으며, 일부 혈청(3종 ELISA 키트 검사 결과가 상이한 혈청 등)에 대해 EITB(OIE 확진검사법) 검

5. 최종 연구결과 요약
1. 항체진단키트 유효성평가를 위한 혈청 패널 구축
- NSP 항체 진단 키트 유효성 평가를 위해 혈청패널(구제역 바이러스 감염 혈청, NSP항체 검출 야외농장 혈청, 백신접종축 혈청, 비백신음성혈청) 873점을 구축함.
- 국내 예찰용으로 사용중인 NSP ELISA 3종 키트(메디안, 바이오노트, 프리오체크), SP-O ELISA 및 VNT 등의 검사 수행하여 기초데이터 분석 완료하였으며, 일부 혈청(3종 ELISA 키트 검사 결과가 상이한 혈청 등)에 대해 EITB(OIE 확진검사법) 검사를 행하여 비특이반응 여부를 최종 확인하였음.
① (구제역 바이러스 감염 혈청) 축종별(소, 돼지, 염소 등) 구제역 바이러스 양성 표준혈청(A-연천, O-보은주 등 국내 야외 바이러스 감염 혈청), 재조합 NSP 항원 접종 혈청 등 612점 생산
② (NSP 항체 검출 야외농장 혈청) 구제역 발생농장의 NSP 항체 양성 혈청, 야외농장 NSP 항체 양성 혈청 등 4,125 시료 확보
③ (백신접종축 혈청) 축종별 구제역 백신 다수접종 혈청, 소 종축장 혈청, 돼지 백신별 접종 혈청 등 1,163 시료 확보
④ (비백신음성혈청) 캐나다산 구제역 비백신 음성혈청(돼지) 50점, 미국산 구제역 비백신 음성 혈청(돼지) 11점 및 국내 구제역 비백신 음성혈청(소) 20점 확보
⑤ (IAEA standard NSP positive control sera & WRFMD NSP reference sara) 세계구제역 표준연구소(Pirbright Institute, 영국) 및 IAEA에서 생산한 NSP 항체 진단용 표준혈정 41종 확보

2. 구제역 바이러스 NSP 단백질 특성 분석 및 진단 항원 후보군 선발
° 면역블롯팅(Enzyme-linked immunoelectro transfer blot assay, EITB)법) 검사법에 활용되는 5개의 NSP (2C, 3A, 3B, 3ABC, 3D)를 항원 단백질로 선정함
- 국내분리주(O형, 4종), O₁-Manisa 및 혈청형별(A, AISA, SAT1~3) target protein인 2C, 3A, 3B, 3ABC, 3D의 상동성 비교 결과 homology가 높게 확인되어 Jincheon strain(O/SKR/2014)을 대표주로 선정함.
° 구제역 바이러스 감염혈청(소) 일자별 5종 단백질 항원 반응성 프로파일링
- EITB와 3종 ELISA 키트를 이용하여 국내분리주(안동주)로 감염시킨 소의 5종 항원단백질에 대한 구제역 감염일자별 혈청 반응성을 프로파일링 한 결과 국산키트 (Median)에서 6DPI에 가장 먼저 양성반응을 나타냈으며, EITB에서는 3D항원에 대해서는 8DPI부터 양성반응성을 보였으나, 5개의 항원 모두에 대해서는 10 DPI부터 양성 반응성 결과가 도출되었으며, 56 DPI까지 지속적으로 5개 항원에 대해서 양성 반응결과를 나타냄.

3. 비구조단백질 5종 진단항원 제작 및 특성분석
° 국내분리 구제역 바이러스(O/SKR 2014)를 이용 비구조 단백질 5종(2C, 3A, 3B, 3ABC, 3D)의 target 유전자를 대장균 및 baculo 발현시스템을 이용 클로닝한 후 정제한 재조합 단백질을 진단 항원용으로 이용하기위해 SDS-PAGE, Weston blot 및 BCA 정량법 등을 통해 특성 분석을 완료함.

4. 재조합단백질 5종의 항원성 평가 및 assay format 선정
° 3종의 assay format(Indirect, sandwitch, competitive)을 이용히여 특이도 높은 rapid assay 조건을 최적화하기 위한 항원성 평가 결과 4종 단백질 항원별로 반응성이 차이가 나타남. E.coli 발현 항원(Capture FMD NSP Ag)과 Baculo 항원 (Detector FMD NSP Ag) 및 Protein A-Conjugate를 이용한 Indirct 및 direct assay format에서 단백질 항원별로 반응성의 차이가 나타나 항원별로 최적의 포맷을 선정함

5. Rapid assay optimization (2019년도, 2년차)
- EITB 진단법과 동일한 조건을 2C 제외 후 4종 NSP(3A, 3B, 3D, 3ABC) 단백질로 최종 target 항원을 선정함
- 전 축종(소,돼지,염소) 대상 32종 버퍼를 이용하여 버퍼 성분 최적화 시험을 수행한 결과 각 항원 단백질별/축종별 선별된 버퍼 종류가 다르므로, 위해도가 가장 높은 소를 우선적으로 선정하였고, 항체별로 최적화된 버퍼를 개별 선별하여 각기 다른 디바이스에 적용함
- 비특이 제거를 위한 전처리 시험(Heat-shock 처리,Incubation time 적용, E.coli lysate, Fusion partner protein, Casein 첨가 시험 등을 수행하여 버퍼조건 최적화 확립

6. Validation of Rapid assay
6.1 Cut-off value 설정
- 각 항원(4종)별로 잠재적 cut-off value 설정을 위해 소 혈청시료 양성(실험실적 구제역바이러스 감염 혈청 및 구제역 발생농장 혈청) 99점 및 음성(백신접종 및 비접종개체 혈청) 355점에 대해 적용하여 ROC (Receiver operation characteristics) 분석한 결과, 민감도 70.0%(항원인자별 78.8-100.0%)와 특이도가 100%(항원인자별 87.0~96.3%)로 평가됨.
6-2. 개발된 NSP 항체 간이진단키트의 성능 평가 및 기진단법간의 비교 평가
(1) 분석학적 민감도(LOD Limit of Detection) 비교 평가 ; 7종 NSP 진단키트)
- 검출능 평가를 위해 NSP 표준양성혈청(O형/A형, 소) 2점을 적용하여 256배까지 단계희석 후 LOD를 평가한 결과, IDEXX키트(미국)가 가장 높았고, 국산키트(M, 피가 시판중인 외산키트 (PrioCHECK)와 동등 수준 이상으로 조사되었으며, Svanova의 경우 전 시료에서 검출한계가 2배~16배까지 낮게 평가됨. Rapid kit와 EITB의 경우, 항원별로 차이가 있었으나, 기 ELISA법과 동등 수준에서 양성을 나타내어 검출한계가 매우 높은 수준으로 조사됨
(2) 분석학적 특이도(LOD Limit of Detection) 비교 평가
- NSP는 7가지 혈청형에 구분하지 않고 보존되는 특성을 가지므로 6종 혈청형 바이러스에 감염된 양성혈청을 적용하여 검사한 결과 모두 양성 결과를 나타냄
- 교차반응성을 조사하기 위해 IBR, BVD 양성혈청 10점을 적용하여 검사한 결과 모두 음성으로 평가됨.
(3) 진단학적 민감도 및 특이도 분석 결과
- 구제역 발생농가, 역학관련 농가 및 NSP 항체 검출 농가 등 소 야외 양성혈청 129점을 적용한 결과 60.5%의 민감도로 조사되었고, 퍼브라이트 국제표준 NSP 양성혈청 10점, IAEA 국제표준 혈청 4점을 적용하여 실험한 결과 82%의 민감도를 보였음.
- 백신접종혈청, 종축장 혈청, 백신미접종 혈청 등 야외 음성혈청 860점에 대해 검사한 결과 100%의 높은 특이도의 결과를 보임.
(4) 진단키트(ELISA 3종) 및 OIE 표준시험법인 EITB법과의 성능 비교 평가
- 상시예찰수행 중 1개 이상의 NSP ELISA kit에서 양성판정된 혈청에 대하여 EITB(458점)법 및 Rapid(1.883점)을 이용하여 비교평가 수행 결과 EITB확진법78.2%, PrioCHECK93.6% 일치율로 각각 조사되어 기 진단법과의 일치율이 상당히 높은 것으로 확인됨.
(5) 백신다수접종 혈청 대상축(소)의 DIVA 변별력 분석 결과
- 개발 중인 NSP 항체 간이 진단키트의 진단학적 특이도 평가를 위해 구제역 백신을 4회 이상 반복 접종한 소의 혈청 시료를 대상으로 NSP ELISA 3종에 대해 검사할 결과 1개 이상의 ELISA 키트에서 양성인 64개중 26개 시료에 대해 EITB 및 Rapid 키트는 음성으로 판정하여 ELISA에 비해 낮은 검출율(34.0%)을 나타냄
- 각 항원별(4종)로 항체반응성을 비교한 결과 3B항원에 대한 항체반응성이 가장 낮아 (변별력, 88.5%) 백신반복접종축에 있어 DIVA Marker로서의 가능성을 나타냄

(출처 : 요약 1p)

Abstract ▼

In order to recover FMD free status within the terms of the 'OIE Code’, NSPs-based diagnostics are essential for large-scale sero-surveillance of FMD to demonstrate freedom from infection and substantiate the absence of virus circulation as a follow up to the vaccination campaign. In this study, we

In order to recover FMD free status within the terms of the 'OIE Code’, NSPs-based diagnostics are essential for large-scale sero-surveillance of FMD to demonstrate freedom from infection and substantiate the absence of virus circulation as a follow up to the vaccination campaign. In this study, we developed new serological diagnostic test kit for DIVA of FMD, multiplex-LFD strip based on multiplex alternatives to western blotting (EITB) which use new clones produced 3ABC, 3A, 3B, 2C, 3D engineered using baculovirus and E.coli expression system to improve specificity. We compared the results obtained by test kit developed with those obtained using the single NS protein either 3AB or 3ABC in ELISA.

This assay was used to test panels of sera from naive, vaccinated, and from experimentally vaccinated-and sequentially infected and infected. This multiplex-LFD strip was specific and precise and as sensitive as 3 kinds of ELISA which detect antibodies to single NSP (3AB or 3ABC). Also, this assay was simple, rapid and reproducible and can be used to identify previous infection in animals which are seropositive for antibody 3ABC or 3AB protein of FMDV.

This study suggested that sera should be tested against more than one NS protein to reduce the false-positive result, either by EITB in a single profile or by examination to several antigens in separate assays as the simultaneous detection of antibody to several NSP provides a clearer identification of infection than the detection of antibody to any single protein. Also, this new assay developed can be a reliable tool for further confirmation as an adjunct to other NSP-based screening kits commercially available for routine sero-surveillance of FMD.

(출처 : Abstract 30p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• I. 연구배경 및 목표 ... 4
• 1. 연구배경 ... 4
• 2. 연구최종목표 ... 5
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 6
• II. 연구방법 및 수행전략 ... 7
• 1. 재 료 ... 7
• 2. 연구전략 및 방법 ... 7
• III. 연구결과 ... 8
• 1. 구제역 비구조단백질(NSP) 항체 검출용 진단키트 유효성 평가를 위한 혈청패널 구축 (2018년도, 1년차) ... 8
• 2. 구제역 바이러스 NS 단백질 특성 분석 및 구제역 감염혈청 반응성 Profiling ... 8
• 3. 구제역 바이러스 재조합-NSP 진단항원 제작 및 특성 분석 ... 10
• 4. 재조합단백질 5종의 항원성 평가 및 assay format 선정 ... 10
• 5. Rapid assay optimization (2019년도, 2년차) ... 11
• 6. Validation of Rapid assay ... 14
• IV. 연구결과요약 ... 26
• 1. 항체진단키트 유효성평가를 위한 혈청 패널 구축 ... 26
• 2. 구제역 바이러스 NSP 단백질 특성 분석 및 진단 항원 후보군 선발 ... 26
• 3. 비구조단백질 5종 진단항원 제작 및 특성분석 ... 26
• 4. 재조합단백질 5종의 항원성 평가 및 assay format 선정 ... 27
• 5. Rapid assay optimization (2019년도, 2년차) ... 27
• 6. Validation of Rapid assay ... 27
• V. 금후 추진계획 ... 28
• VI. 참고자료 ... 29
• VII. 영문초록 ... 30
• 끝페이지 ... 30