초록 ▼

· 국내·외 유라시아지역에서 분리된 주요 조류인플루엔자 바이러스의 유전정보를 바탕으로 M/H5/H7 유전자 특이적인 Primer 및 Probe 후보군 제작(검역본부 및 3개 업체 개별 제작)

· 진단키트의 표준화를 위해, 각 primer/probe set 후보군을 비교평가하여 가장 우수한 반응성을 보이는 것을 선정하여 공동으로 사용하기로 협의하고, 진단키트 사용처(시도 가축 방역기관)의 진단키트 사용의 편리성, 효율성을 고려하여 RT-PCR 조건(2 step, 60℃) 등 도 통일하기로 함

· 제작된 M/H

· 국내·외 유라시아지역에서 분리된 주요 조류인플루엔자 바이러스의 유전정보를 바탕으로 M/H5/H7 유전자 특이적인 Primer 및 Probe 후보군 제작(검역본부 및 3개 업체 개별 제작)

· 진단키트의 표준화를 위해, 각 primer/probe set 후보군을 비교평가하여 가장 우수한 반응성을 보이는 것을 선정하여 공동으로 사용하기로 협의하고, 진단키트 사용처(시도 가축 방역기관)의 진단키트 사용의 편리성, 효율성을 고려하여 RT-PCR 조건(2 step, 60℃) 등 도 통일하기로 함

· 제작된 M/H5/H7 검출용 primer/probe set 후보군의 효율성을 비교 평가결과,
▷ M 유전자 및 H5 유전자 검출용 primer/probe set는 민감도 및 반응조건을 고려하여 A사 제품으로 선정
▷ H7 유전자 검출용 primer/probe set은 민감도 및 반응조건을 고려하여 C사 제품으로 선정

· 현재 많이 사용되고 있는 6종(manual 3종, automatic 3종)의 RNA 추출키트를 사용하여 효율성을 평가한 결과 일부 시료에서는 manual 추출 키트들이 automatic 추출키트들에 비해 CT값이 낮았으며 평균값의 차이는 0.05~1.33이었음

· 선정된 primer/probe set 및 반응 조건 등을 적용한 시제품을 업체별로 제작한 후, 검역본부에서 공급한 18종의 바이러스와 검출한계 측정용 RNA 3종을 이용하여 자체 평가를 완료하고 업체별 생산조건을 확립하였음
▷ 장비별 baseline은 CFX96: 200, AB7500: 25,000, primer/probe 농도는 업체별 최적조건 확립, IC는 CT값 22±2 나오도록 업체별로 최적 농도 설정 등 생산조건 확립
▷ 검출한계 측정 평가결과 M gene의 경우 10¹~10² 까지, H5 gene의 경우 10² 까지, H7 gene의 경우 10²~10⁴ 까지 검출이 가능한 것으로 확인되었음
▷ 제공된 18종의 바이러스 표준품 등을 이용하여 업체에서 생산한 시제품에 대하여 자체적으로 평가를 실시한 결과 민감도와 특이도에 문제가 없었음

· 업체별로 확립된 조건에 따라 생산된 시제품을 제공받아, 74종의 바이러스를 이용하여 민감도와 특이도 검사 및 374점의 야외 시료(분변 및 스왑 등)을 이용한 민감도와 특이도 검사를 실시하였음
▷ 국내 분리주 등 74종의 바이러스를 시료로 사용하여, 각 업체별로 생산하여 제공한 시제품에 대한 검사를 실시한 결과 A, B, C 3사 시제품 모두 특이도와 민감도 100%의 결과 확인하였음
▷ 실시간 유전자 진단키트를 실제 적용할 야외시료(야생조류 분변 및 가금류 스왑/분변 시료 등)를 이용(양성시료 128개, 음성시료 246개)하여 시제품의 민감도 및 특이도를 검사한 결과, 민감도는 88~96%, 특이도는 99%이상으로 확인되었음

(출처 : 연구결과 요약 2p)

Abstract ▼

The specific primer & probe kit, for M/H5/H7 gene detection, based on genetic information of recently isolated HPAI viruses in Eurasia region were developed by APQA research team and 3 cooperative companies. For the standardization, the standard condition of RT-PCR (2 step, 60℃) was applied to all t

The specific primer & probe kit, for M/H5/H7 gene detection, based on genetic information of recently isolated HPAI viruses in Eurasia region were developed by APQA research team and 3 cooperative companies. For the standardization, the standard condition of RT-PCR (2 step, 60℃) was applied to all the developed kits for user friendliness and efficacy. After repeated tests, finally each primer & probe sets for the detection of M, H5 and H7 gene were selected. The 3 cooperative companies had produced the trial batch and tested by themselves to set up the producing conditions. The LOD (Limit of Detection)s were defined as 10¹~10² for M gene, as 10² for H5 gene, and as 10²~10⁴ for H7 gene. For the trial batches of 3 companies, the sensitivity and the specificity were tested using samples of 74 viruses to show the result as 100% for each sensitivity and specificity. Also, field samples such as feces, OP swabs and CL swabs (128 positive samples and 246 negative samples) were applied to test for sensitivity and specificity. As the result, sensitivity was estimated as 88~97% and the specificity over than 99%.

(출처 : 영문초록 21p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 농림축산검역검사기술개발 연구과제 최종결과보고서 Final Report (FR) ... 2
• Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 4
• 1. 연구배경 ... 4
• 2. 연구최종목표 ... 5
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 5
• Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 6
• 1. 재 료 ... 6
• 2. 연구전략 및 방법 ... 6
• Ⅲ. 연구결과 ... 7
• Ⅳ. 연구결과요약 ... 18
• Ⅴ. 참고문헌 ... 20
• VI. 영문초록 ... 21
• 끝페이지 ... 21