초록 ▼

5. 최종 연구결과 요약

○ 세부과제명: 조류인플루엔자 정밀진단 표준화 및 효율성 향상 연구
- 목표 1 : 조류인플루엔자 진단연구용 표준품 패널 구축
o (재조합 베큘로바이러스 제작) 국내 대표 분리주 7주 (H5형 4, H7형 2, H9형 1)를 후보주로 선정하고 HA 유전자 부위를 삽입하여, 최종적으로 부유세포 상층액으로 rHA를 발현하는 재조합 베큘로바이러스 제작 (1~5 x 10⁶ FFU/ml (P5 기준) 확인). * FFU: Focus Forming Unit
o (재조합

5. 최종 연구결과 요약

○ 세부과제명: 조류인플루엔자 정밀진단 표준화 및 효율성 향상 연구
- 목표 1 : 조류인플루엔자 진단연구용 표준품 패널 구축
o (재조합 베큘로바이러스 제작) 국내 대표 분리주 7주 (H5형 4, H7형 2, H9형 1)를 후보주로 선정하고 HA 유전자 부위를 삽입하여, 최종적으로 부유세포 상층액으로 rHA를 발현하는 재조합 베큘로바이러스 제작 (1~5 x 10⁶ FFU/ml (P5 기준) 확인). * FFU: Focus Forming Unit
o (재조합 단백 발현 및 특성 분석) 각 후보주들의 rHA 재조합 단백 발현을 확인하고, 닭 혈구 응집능(HA) 검사를 실시한 결과, 역가가 2⁴~2⁸ 측정됨. 닭 혈구 응집억제능(HI) 검사를 통해 진단항원으로서의 적합성을 평가한 결과, H7형이 응집능이 높고 다른 아형과의 교차반응 (응집)이 낮아 항원성이 양호한 것으로 평가됨. 생산 수율과 비용을 비교하여, 기존 SPF종란을 통한 불활화 바이러스 항원생산의 실질적인 대체 가능성을 평가함
o (진단표준품 바이러스 선발 및 구축) HxNx subtype별 표준 후보주 60주를 선발하여, 증식, 역가 측정 및 동일성 평가를 거쳐 최종 50주(45개 아형 조합)를 선발하여 표준품 패널로 구축하였고 전장유전체 분석(NGS)을 수행함.
o (진단 표준품 보관 환경 개선) 온도, 습도 등을 실시간 IoT 모니터링 시스템을 도입하여 시범 운영함
- 목표 2 : 조류인플루엔자 유전자 진단법 개선 및 표준화
o (rRT-PCR 검증) 2017년 하반기부터 2018년 상반기까지 국내를 포함한 유라시아 지역에서 분리된 바이러스들의 M과 H5 유전자에 대해 기존 방법(ORL)과 신규개발 방법(산업체공동연구 산물)의 프라이머·프로브 매칭율 확인 결과, ORL은 88~95.8% 인 반면 신규개발 방법은 100%임을 확인하였고, H5 및 H7 항원 표준품을 사용 LOD 테스트 결과 약 10배 정도 민감도가 향상된 것을 확인하여 개선된 진단법의 유효성을 확인함. ‘19/20년 추가적인 검증을 통해 현장 적용할 예정임.
o (타입핑 End-point RT-PCR 개선) 야생조류 유래 국내 분리주에 대한 타입핑 정확도 향상을 위해, H8형과 H12형의 primers를 개선하고 민감도와 특이도 확인 결과, 다른 아형과의 교차반응 없이 민감도 개선을 확인함. ’19년부터 AI야생조류 예찰에 활용중임.

○ 제2 세부과제명: 조류인플루엔자 정밀진단 검증체계 개발 연구
- 목표 1: 조류인플루엔자 정밀진단 전문가 양성 교육 및 검증 시스템 개발
o (교육프로그램 개선) 현장 수요 반영 및 문제해결 능력 배양에 중점을 두고, ’18~19년 AI 정밀진단 교육 개선방안 및 연간 계획을 수립하여 시행. 특히, ‘18년 상반기 교육부터 교육 프로그램을 다양화하고 선택 실습 도입 등 수요자 맞춤형 교육을 추진함.
* 교육 후 설문조사 결과, 교육 내용에 대한 만족도가 높아지고, 문제해결형 프로그램 도입에 긍정적 반응을 보임
o (해외 사례 적용) 해외 연수 사례와 입수한 교육 교재 등을 활용, 진단교육 내용에 반영하고 지자체 시험소 AI 진단요원과의 해외 OIE 표준실험실 공동연수를 통해 선진 진단기법 및 인프라에 대한 지식과 견문을 넓힘
o (진단매뉴얼 작성) 시·도 방역기관에서 조류인플루엔자 정밀진단에 활용할 수 있는 진단 매뉴얼을 제작하여 배포함(2018.12)
- 목표 2: 실험실 정밀진단 정도관리 등 검증방법 강화 연구
o (정도관리 체계 개선) 반기별 정도 관리(연 2회)를 실시하고 수요자 요청에 따른 현장 방문교육을 통해 현장 활용 장비를 이용하여 맞춤형 쌍방향 교육을 실시함. 전국 35개 이상 시험소 (본소, 지소)를 대상으로 실시간유전자진단법(rRT-PCR)에 대한 과학적인 정도검사를 위해 Z-score 및 Youden plot 활용 분석 체계를 수립(2018)하고, 이에 따라 2019년부터 분석에 적용함

(출처 : 요약 1p)

Abstract ▼

The panel of avian influenza virus for producing antigen and antiserum for the purpose of diagnosis is decided and the viruses were cultivated in the embryonated eggs and harvested. In total, 50 virus strains of 45 subtypes in the allantoic fluid were selected and kept at a deep freezer, and all th

The panel of avian influenza virus for producing antigen and antiserum for the purpose of diagnosis is decided and the viruses were cultivated in the embryonated eggs and harvested. In total, 50 virus strains of 45 subtypes in the allantoic fluid were selected and kept at a deep freezer, and all these viral genomic sequences were read using NGS system. The real-time system for monitoring temperature and humidity of the refrigerators were tested and the its benefits for maintaining good condition for the storage system were verified. The recombinant baculovirus expression system was introduced for the production of diagnostic antigen, hemagglutinin, to replace the diagnostic antigen, inactivated viruses, in the current HI system for serological tests for H5, H7 and H9. Newly developed rRT-PCR kit for detecting M, H5 and H7 genes were tested in comparison to the old one, publicly known and used worldwide. The primers and probe employed in the new tests were designed to represent better the recent avian influenza isolates found in the Eurasia regions. At the same time, the typing end-point RT-PCR for avian influenza was also modified in some subtypes by replacing the primers with the information of the newly collected isolates during avian influenza surveillance to increase the accuracy and the coverage of detection. The training program for diagnostician and the technical guidelines and procedures for national proficiency test in rRT-PCR against provincial veterinary services were developed for harmonized national surveillance results and standardization. Techincially, the analysis using the Z-score and Youden plot was helpful to understand the dispersion of the test results among the participants. There are diverse factors to increase the deviation of the results of rRT-PCR even with the same samples among them like the equipments, different nucleic acid extraction kits and the different manufacturers of the commercial rRT-PCR kits. But it was found that any factors are consistently and significantly influenced the different results among the praticipants.

(출처 : Abstract 27p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• I. 연구배경 및 목표 ... 3
• 1. 연구배경 ... 3
• 2. 연구최종목표 ... 4
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 5
• II. 연구방법 및 수행전략 ... 5
• 1. 재 료 ... 5
• 2. 연구전략 및 방법 ... 6
• III. 연구결과 ... 7
• 1. 제1세부과제명: 조류인플루엔자 정밀진단 표준학 및 효율성 향상 연구 ... 7
• 2. 제2세부과제명: 조류인플루엔자 정밀진단 검증체계 개발 연구 ... 16
• IV. 연구결과요약 ... 23
• V. 고 찰 ... 25
• VI. 참고자료 ... 26
• VII. 영문초록 ... 27
• 끝페이지 ... 27