초록 ▼

◦세부과제명: 생체분비물을 이용한 CWD 변형프리온 검출기법 개발
- 생체분비물의 변형프리온 농축기법을 확립하기 위하여 BSE 지속감염세포를 키운 배지에서 exosome을 추출하는 방법을 확립하였음. 프리온 특이항체와 단백분해효소를 이용하여 exosome 검출 시판 키트를 적용한 결과, 변형프리온이 존재함을 확인하였고 exosome 표지마커를 이용하여 exosome이 추출됨을 확인하였음.
- 농축기법의 또 다른 방법으로 Na-PTA를 이용한 전처리 후 면역블로팅을 적용하였을 경우, 일반 면역 블로팅보다 Na-PTA 적용시

◦세부과제명: 생체분비물을 이용한 CWD 변형프리온 검출기법 개발
- 생체분비물의 변형프리온 농축기법을 확립하기 위하여 BSE 지속감염세포를 키운 배지에서 exosome을 추출하는 방법을 확립하였음. 프리온 특이항체와 단백분해효소를 이용하여 exosome 검출 시판 키트를 적용한 결과, 변형프리온이 존재함을 확인하였고 exosome 표지마커를 이용하여 exosome이 추출됨을 확인하였음.
- 농축기법의 또 다른 방법으로 Na-PTA를 이용한 전처리 후 면역블로팅을 적용하였을 경우, 일반 면역 블로팅보다 Na-PTA 적용시, 10배 정도 민감함을 확인하였음.
- 기확립된 PMCA기법(소량의 시료를 증폭하여 검출하는 방법)을 개량하기 위하여 bead 종류별, 크기별로 확인하여 본바 내마모성이 강한 teflon bead를 사용한 경우 기존 PMCA법보다 100배 더 민감 하였음.
- 재조합단백질을 기질로 이용하여 변형프리온을 conversion하는 RT-QUIC은 full sequence재 조합단백질(23-231)을 사용하여 확립하였음.
- 뇌조직 및 인두후림프절, 생체조직에 대한 RT-QUIC 반응조성과 프로그램을 확립하여 CWD 자연 감염된 사슴의 뇌 및 림프절에서 변형프리온이 검출되었다. CWD 감염 후 시기별로 도태한 형질전환 마우스의 뇌를 시료로 적용한 바, 10dpi부터 120dpi까지 모두 개체에서 검출되었음.
- ELISA 결과 인두후림프절만 양성으로 확인되는 준임상형 시료에서 RT-QUIC을 적용하여 본바 인구후 림프절은 모두 양성 이었고 인두후 림프절의 OD가 2.0이상이어야 ELISA에서 음성인 뇌조직에서 양성으로 확인되어 보다 민감한 방법임을 확인함
- CWD 감염 타액 및 뇨 시료는 Na-PTA방법으로 농축 후 RT-QUIC을 적용함. 타액의 경우 실험감염 시료 2개와 야외 시료 3개를 적용하여 본바 말기로 진행될수록 변형프리온을 확인할 수 있었음. 뇨의 경우 실험감염시킨 말기시료 밖에 없었으며 확보한 2두 시료 모두 양성으로 확인됨. 이들 시료의 감염력 여부를 확인하기 위하여 형질전환 마우스에 뇌내 접종하였고 뇌척수액은 100% 공격률을 나타내었으며, 생존기간으로 환산하여 본 결과 뇌조직보다 뇌척수액의 경우 1,000배정도 뇨의 경우는 10,000배정도 낮은 것으로 확인함.
- 시기별로 도태한 형질전환 마우스모델을 이용한 뇨에서 변형프리온 검출은 30일, 45일 후에 변형프리온이 확인되었다가 60일과 75일에서는 사라지고 90일, 105일, 120일에서 다시 검출되는 것으로 확인됨. 이는 혈액에서 변형프리온 검출되는 것과 유사한 결과를 도출 된 것임. 또한 뇨에서 변형프리온의 분포양상을 확인하기 위하여 신장에서 RT-QUIC 방법을 적용한 결과 거친피모가 확인되는 90일 이후부터 120일까지 양성이 확인됨. 초기에 뇨로 변형프리온이 배출되다가 임상증상이 관찰되는 90일 이후부터 신장에 축적되는 것으로 추정됨.
- 뇌척수액의 경우 7ul 용량에 42℃로 반응하였을 때 최적의 결과를 도출함.
- 혈액에 대한 진단법을 확립하기 위하여 혈액에 CWD감염 뇌유제액을 희석배수별로 첨가하여 혼합한 후 혈장을 분리하여 PMCAb와 RT-QUIC적용한바 PMCAb 1R 후 RT-QUIC을 수행하는 것이 민감한 것으로 확인되어 확보한 혈장을 이용하여 수행한 바 감염축은 양성으로 비감염축은 음성으로 확인됨.

◦세부과제명: CWD spike 토양에서 CWD 검출 및 감염력 확인
- 본 세부과제는 2014년 완료된 세부과제의 연결과제로 CWD를 4개월간 노출시킨 토양(CWD spike 토양)을 최소 잠복기인 3년간까지 실온에 유지한 후, 그 토양에서 변형프리온을 검출하고 감염력을 확인하고자 함. CWD spike 토양은 CWD 노출 양에 따라 1~0.001%까지의 토양을 만들었으며 현재 3년까지의 토양을 확보하였음
- 확보된 CWD spike토양에서 직접 변형프리온을 검출할 경우에는 변형프리온이 검출되지 않았음. 토양과 결합되어 있는 변형프리온을 검출하기 위하여 세척방법을 사용하였음. 1회부터 10회까지 토양세척액에서 PMCA를 적용하여 본 바, 1~0.001%까지 변형프리온이 증폭되었음. 이들 토양에 대한 감염력을 확인한바 1~2년까지는 0.001~0.1%까지 모두 감염되었음
아직 진행 중이기는 하나 3년째에도 0.01%까지는 감염되는 것으로 확인됨.
- 2010년 CWD 발생당시 농장에서 채취된 토양에서도 동일한 방법으로 변형프리온의 검출을 시도하였고 4곳 중 3곳에서 변형프리온의 증폭을 확인하였음.
- CWD 미발생 농장 토양은 변형프리온의 증폭은 관찰되지 않았으며, 이전 CWD 발생농장 3곳의 토양 중 충남 및 경북소재 농장은 음성으로 확인되었고 진주소재 농장은 양성으로 확인이 되었음.
- 2016년 CWD 발생으로 농장토양에서 PMCAb방법을 적용하여 본바 CWD 발생농장은 시료를 확보한 5개 농가에서 양성으로 확인 되었으며 역학관련 농가에서도 3개 농장에서 양성을 확인하였음
- OIE에 등재된 소독제인 2~3% NaClO와 2N NaOH를 활용하여 토양의 소독정도를 확인하 였음. 소독제의 권장농도로 0.5g의 토양을 소독제의 용량별로 적용하여 본 바, 2~3% NaClO의 경우, 토양 용량과 동일하게 16시간 동안 반응하였을 때 소독이 가능하였고, 2N NaOH의 경우는 토양의 1/5용량으로 1시간만 처리하여도 소독이 가능하였음.
- 야외농장상황을 반영하기 위하여 35L의 오염토양을 만들었으며 PMCAb로 변형프리온이 존재함을 확인하였다. 4주째부터 시료를 확보하여 검사를 실시하였으나 NaOH는 50% 효과를 나타내고 NaClO는 효과가 없어 보다 많은 양의 소독액을 도포하여야 할 것으로 판단되었음

(출처 : 연구결과 요약 2p)

Abstract ▼

Chronic wasting disease (CWD) is the only prion disease affecting free-ranging animals, has been reported in North America, South Korea and Norway. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), western blotting (WB), immunohistochemistry(IHC) and bioassay have been used in prion disease diagnosis a

Chronic wasting disease (CWD) is the only prion disease affecting free-ranging animals, has been reported in North America, South Korea and Norway. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), western blotting (WB), immunohistochemistry(IHC) and bioassay have been used in prion disease diagnosis and surveillance. The developments of amplification-based seeding assays have been instrumental in the detection of low levels of infectious prions in clinical samples. Using serial protein misfoldng cyclic amplification with beads (sPMCAb) and real-time quaking-induced conversion (RT-QUIC), we established a sensitive detection method for PrP^CWD in the brain samples of CWD affected cervids. The titer was 10 ^5.6 ic LD₅₀/gram of elk brain, making the sPMCAb and RT-QUIC similar in sensitivity to end-point dilution bioassay. These sensitive detection methods will provide a useful tool to facilitate the study of pathogenesis and the diagnosis of CWD. Unlike in most other prion disease CWD agents are shed in blood, urine and feces which most likely contribute to the horizontal transmission between cervid species. The developments of amplification-based seeding assays have been instrumental in the detection of low levels of prions in clinical samples. Using real-time quaking-induced conversion (RT-QUIC), we established an ultrasensitive detection method for PrP^CWD in the urine from CWD-infected sequentially sampled transgenic mice overexpressing elk prion protein (TgElk mice). In addtion, RT-QUIC was performed in the kidney and brain of theses mice model to trace abnormal prion.
We demonstrate that CWD prions can be detected by RT-QUIC or NaPTA/RT-QUIC in the brain, kidney and urine of TgElk mice at the early and terminal stages of disease. Based on these data, we suggest that PrP^CWD is excreted into only urine until 90 dpi and then slowly accumulated in kidney. Our results can be used in designing future study of CWD pathogenesis in TgElk mice.

Transmissible spongiform encephalopathy (TSE) is a fatal neurodegenerative disorder, which is so-called as prion diseases due to the causative agents (PrP^Sc). TSEs are believed to be due to the template-directed accumulation of disease-associated prion protein, generally designated PrP^Sc.
Chronic wasting disease (CWD) is the prion disease that is known spread horizontally. CWD has confirmed last in Republic of Korea in 2016 since first outbreak of CWD in 2001. The environmental reservoirs mediate the transmission of this disease. The significant levels of infectivity have been detected in the saliva, urine, and feces of TSE-infected animals. Soil can serve as a stable reservoir for infectious prion proteins. Using serial protein misfolding cyclic amplification with beads (sPMCAb), we developed a detection method for CWD PrP^CWD in soil from CWD affected farm in 2010. We found to detect PrP^CWD in soil from CWD infected farm, but not detect PrP^CWD in soil of normal cervid farm in Korea. We had collected 39 soil samples from the farms confirmed CWD outbreak in 2010 and 2016. 5 CWD- infected farms in 2010 and 2016. After three rounds of sPMCAb, we detected PrP^Sc in only seven samples from areas which were positive animals habitat. This results suggest that our method can be a very useful tool for monitoring PrP^Sc contamination in environments. Our method appears to be a very useful technique for monitoring PrP^CWD levels in environmental conditions. We found that CWD contaminated soil which has kept at room temperature until 3 years after 0.001~1% CWD exposure and natural CWD-affected farm soil contained infectious prions from through Tg Elk mice bioassay.

(출처 : 영문초록 19p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 농림축산검역검사기술개발 연구과제 최종결과보고서 Final Report (FR) ... 2
• I. 연구배경 ... 5
• 1. 연구배경 ... 5
• 2. 연구개발의 최종목표 ... 6
• 3. 연차별 연구개발 목표와 내용 ... 6
• II. 연구방법 및 수행전략 ... 7
• 1. 재료 ... 7
• 2. 연구전략 및 방법 ... 7
• III. 연구결과 ... 8
• Ⅳ. 연구결과요약 ... 30
• V. 고찰 ... 32
• 1. 생체분비물을 이용한 CWD 변형프리온 검출기법 개발 ... 32
• 2. CWD 오염토양에서 PrPCWD 검출 및 감염력 확인 ... 33
• Ⅵ. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 35
• Ⅶ. 주요연구 변경사항 ... 35
• Ⅷ. 참고자료 ... 35
• IX. 영문초록 ... 37
• 끝페이지 ... 38