[보고서]유전체/전사체/표현체학(phenomics)을 이용한 벼 내재해 유전자 발굴

김성룡

유전체/전사체/표현체학(phenomics)을 이용한 벼 내재해 유전자 발굴
Development of novel stress resistance gene of rice through genomics/transcriptomics/phenomics study 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	서강대학교 Sogang University
연구책임자	김성룡
참여연구자	Manu Kumar , 전지형 , 최주영
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2018-02
과제시작연도	2017
주관부처	농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA)
등록번호	TRKO201800043654
과제고유번호	1395049087
사업명	차세대바이오그린21
DB 구축일자	2019-05-18
키워드	벼.내재해성.유용유전자.OsSta2.rice.abiotic stress tolerance.genetic resource.
DOI	https://doi.org/10.23000/TRKO201800043654

초록 ▼

유전체/전사체 분석과 스트레스 검정을 통한 내재해성 변이주 발굴과 작물의 환경 스트레스 내성 연구의 중요성이 날로 커짐으로서 본 연구에서는 japonica와 indica 품종의 저온스트레스와 관련된 전사체 분석을 통하여 내재해성에 관여하는 유전자들을 발견하고 내재해성 벼인 OsWRKY71 -Ox 및 OsSta1- Ox 라인을 제작 및 발굴하였고 OsSta2 -D와 OsSta2 -Ox라인을 제작 및 발굴하여 내재해성 및 작물 생산증대를 확인하였다.

또한 UPS (Ubiquitin-26S Proteasome System)은 중요한 생체 조절 체계로 내재해성과 연관이 커 본 연구에서 식물의 스트레스 반응에서의 UPS 작용에 대한 이해를 하고자 내재해성 E3 ubiquitin ligase 돌연변이인 eul117,123,134 와 ATL5-D 의 내재성을 확인하고 EUL123가 ABA pathway에 관여한다는 것과 OsATL5가 결합하는 단백질을 확인하였다.

(출처 : 보고서 요약서 4p)

Abstract ▼

Purpose&Contents
Because the Importance of identification of abiotic stress tolerant mutants through genome / transcript analysis and study on abiotic stress response is continuously increasing, we identified genes involved in cold stress response through analysis of transcripts with japonica and indica rices and found cold tolerant OsWRKY71-Ox lines. we made salt and drought tolerant OsSta1-Ox, OsSta2-Ox lines. Also, we got phenomic data of OsSta2-D and OsSta2-Ox after drought stress.

UPS(Ubiquitin-26S Proteasome System) is an important bio-regulatory system that is associated with disaster tolerance. To understand the relationship between UPS and abiotic stress response regulation, we investigated abiotic stress tolerant E3 ubiquitin ligase mutations eul117, 123, 134 and ATL5-D, and confirmed that EUL123 is involved in the ABA pathway and the protein binds to OsATL5.

Results
New abiotic stress tolerant rice OsSta1-Ox lines were constructed. we checked abiotic stress tolerance of OsATL5, mutant of E3 ubiquitin ligase in UPS, and got phenomics data of OsATL5-D after drought stress. Also, we identified the protein binds to OsATL5.
Similarly, we checked abiotic stress tolerance of eul117, 123, 134 which are mutants of E3 ubiquitin ligase in UPS and EUL123 was found to be involved in the ABA pathway. We have published the paper on the characterization of salt and drought stress tolerance of OsSta2 and phenomic data of OsSta2-Ox lines. Also, we have published the paper describing characteristics of OsGASR1 mutant.
Similary, We have published the paper on the characterization of cold tolerant OsWRKY71-Ox lines and the analysis of cold stress response mechanism using transcriptomics data between japonica and indica rices.

Expected Contribution
Our results will contribute on securing of genetic resources related with abiotic stress tolerance and constructing system for study on production of abiotic stress tolerant to prepare global climate change.
Also, we expect to have patents on abiotic stress tolerant transgenic lines and technology transfer to different crops.

(출처 : Summary 6p)

목차 Contents

표지 ... 1
제 출 문 ... 3
보고서 요약서 ... 4
국 문 요 약 문 ... 5
Summary ... 6
목차 ... 7
제 1 장 연구 개발 과제의 개요 ... 8
제1절 연구 개발 목적 ... 8
제2절 연구 개발의 필요성 ... 8
제3절 연구 개발 범위 ... 8
제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 9
제 3 장 연구 수행 내용 및 결과 ... 11
제 4 장 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 24
제1절 : 목표대비 달성도 ... 24
제2절 : 정량적 성과(논문게재, 특허출원, 기타)를 기술 ... 25
제3절 : 연구성과의 활용·확산 목표 및 달성도를 기술 ... 26
제 5 장 연구 결과의 활용 계획 ... 26
제 6 장 연구 과정에서 수집한 해외 과학 기술 정보 ... 26
제 7 장 연구 개발 결과의 보안 등급 ... 27
제 8 장 국가과학기술지식정보서비스에 등록한 연구시설·장비 현황 ... 27
제 9 장 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 27
제 10 장 연구개발과제의 대표적 연구실적 ... 28
제 11 장 기타 사항 ... 29
제 12 장 참고 문헌 ... 29
끝페이지 ... 34

표/그림 (23)

표 EUL117, EUL123, EUL134, EUL148 유전자와 T-DNA 삽입 모식도. EUL117, EUL134는 F-box domain, EUL 123은 WD domain, EUL148은 RING domian을 갖는 E3 ubiquitin ligase 이다
표 EUL 유전자와 해당 돌연변이체에서의 유전자 발현 양상. a. EUL123은 knoukout 돌연변이인 eul123-1, eul123-2에서 발현이 검정되지 않은 반면 과발현체인 EUL123 Ox15에서는 overexpression이 확인되었다. b. EUL117에 대한 KO 돌연변이체인 eul117-1에서 WT에 비해 해당유전자의 발현이 검출되지 않았다. c. EUL123의 각 조직별 발현량 조사. Ca, 캘러스; Ss, 발아한지 7일후 지상부; Sr 발아한지 7일후 뿌리; Lf, 성숙한 잎; Ls, 지엽; Ih, 출수기 전 제일 높은 마디사이; P1, 1-2 cm panicles; P2, 3-8 cm panicles d. EUL148 유전자 발현은 KO 돌연변이인 eul148-1과 eul148-3에서 검출되지 않았다
표 EUL117 과 EUL123의 스트레스 검정 결과
표 EUL134의 스트레스 검정 결과
표 eul123-1의 염분스트레스 검정 결과. 250mM에서 84시간동안 염분 스트레스를 처리하고 6일간 회복시킨 후에 형태적인 차이를 비교한 사진으로 eul123-1에 비해서 WT은 잎이 더 노랗고 시들었으며 키가 작음을 알 수 있다. 같은 염분 스트레스 처리 이후 생질량 차이를 분석한 결과,n=10.염분 스트레스 처리 후 WT과 eul123-1의 형태적인 특징을 비교한 사진이다. eul123-1에 비해 크기가 작고 야생형 잎이 더 노랗고 시든 것을 확인할 수 있었으며 생질량에서 유의미한 차이를 보인다
표 EUL123 돌연변이의 0μM ABA에서 발아실험. EUL123 형질전환체와 야생형 종자의 발아는 거의 비슷한 양상으로 나타남
표 EUL123 돌연변이의 5μM ABA에서 발아실험. EUL123 형질전환체 중 과발현이 확인된 EUL123 ox15에서 발아가 더 빨리 일어나는 ABA insensitive 형질이 관찰되었으나, EUL123 KO mutant line들에서는 발아가 지연되는 ABA hypersensitive 형질을 나타내었다
표 EUL126 활성변이주 OsATL5-D의 저온 스트레스 내성 검정. (a) 8 DAG OsATL5-D 돌연변이를 4oC에서 4일간 스트레스를 준 후 6일간 회복 후 사진. (b) OsATL5-D 돌연변이의 내냉성표. a생존 seedlings의 수/ 전체 seedlings 수. b돌연변이와 WT간의 상당한 차이(*)를 표시(χ2 test P<0.05). (c) 회복 후 생중량. (D) 회복 후 건량
표 OsATL5-D돌연변이는 건조 스트레스 검정. (a) 8 DAG인 OsATL5-D 를 건조 스트레스를 처리 후 6일간 회복 후 사진. (b) OsATL5-D 의 내재해성표 a생존한 seedlings의 수/ 전체 seedlings 수. b돌연변이와 WT간의 상당한 차이를 표시(χ2test P<0.05). (c) 회복 후 생중량. (D) 회복 후 건량
표 대량고속 이미지 분석에 기초한 OsATL5-D 건조 저항성 페놈(표현체) 연구. (a) OsATL5-D 의 건조 처리 전(C), 처리 직후(D), 그리고 3단계에 걸친 회복과 건조 처리 후 (R0, R1 and R2)의 이미지. (b) 건조 스트레스 동안 Green projected area (GPA) 표시. (c) 건조 스트레스 동안 Green projected area ratio (GPAR) 표시. (d) 건조 스트레스 동안 Relative dark green projected area (RDGPA) 표시. 별표(*)는 돌연변이와 WT간 통계적 차이 있음(ttest, P<0.05)을 나타냄
표 OsATL5-D 돌연변이의 ABA 민감성 과 ROS 저항성 분석.(a) 1/2 MS 배지에서 키운 3DAG 식물체를 ABA와 H2O2를 처리한 배지에서 7일간 키운 사진. (b) (A)결과 중 Shoot 길이. 오차막대는 +표준오차(n=9 seedlings per experiment). OsATL5-D 돌연변이는 ABA 처리시 WT보다 덜 민감하였다
표 세포내의 위치와 in vitro에서 OsATL5의 self-ubiquitination 위치 확인. 양파 표피 (A) 및 옥수수 원형질 (B)에서 PUbi-OsATL5-sGFP의 일시적인 발현. 야생형 원형질체를 Pubi-OsATL5-sGFP 또는 P35S-BiP-mRFP로 형질전환시키고 Pubi-OsATL5-sGFP의 녹색 형광 신호를 조사 하였다. Pubi-OsATL5-sGFP의 형광 신호는 P35S-BiP-mRFP의 적색 신호와 밀접하게 겹침
표 Yeast Two-Hybrid Screening of OsATL5. (A) Self activity test of OsATL5 bait in PBN204 strain. (B) Self activity test of OsATL5 bait in AH109 strain. (C) Prey identified from Bait B screening in PBN204. (D) Prey identified from Bait B screening in AH109
표 OsSta1 클로닝 및 형질전환
표 OsAec1 유전자 모식도. T-DNA는 막 수송 단백질 domain을 갖는 유전자의 상류에 삽입된 것으로 나타났음
표 OsAec1의 염 스트레스 저항성 결과
표 OsAec1의 Crispr/Cas9 binary vector 구축 모식도. pOs-sgRNA의 BsaI 위치에 target 염기서열 삽입 후, Gateway cloning을 이용하여 Cas9과 OsAec1 targeting sgRNA을 갖는 binary vector를 건축하였음. Agrobacterium 형질전환 후, 현재 동진벼에 도입되고 있음
표 염분, ABA 유도성 T-DNA 삽입 돌연변이 osgasr1 (A)T-DNA삽입 돌연변이 라인 0–175–70의 성숙한 T1식물의 가장 어린 tiller 부분을 각각 Control(25℃), 저온(5℃), 염분 (300mM NaCl, 25℃), ABA(100μM, 25℃)조건 하에서 12시간동안 처리하여 GUS 분석 결과.(B) 0–175–70 (osgasr1-1), 1C-080-12 (osgasr1-2) 계통의 T-DNA삽입 위치 개념도. 회색 상자는 엑손 나타냄
표 2엽 유식물 시기의 osgasr1 표현형 (A) 발아 후 7일동안 MS 아가 배지에서 유식물을 키운 상태. 붉은 화살표는 두 번째 잎을 나타냄. (B) 발아 후 9일차에 첫 번째 잎, 두번째 잎몸, 두 번째 잎집의 길이. (C) 발아 후 10일차 잎몸 표면의 주사전자현미경 관찰 결과. B, 기동세포(bulliform cells); R, 관다발 위의 표면 융기세포(epidermal ridge cells over vascular bundles; S, 기공(stomata). (D) 기동세포, 표면 융기세포, 기공의 길이(Student’s t-test, ** P < 0.01)
표 osgasr1 돌연변이에서 α-amylase 발현 분석 (A) 8가지 α-amylase (RAmy) 유전자들에 대한 RT-PCR 분석 결과, RAmy1A, B, C, 3B, 3E 의 발현이 증가됨을 알 수 있었으나, RAmy13D 의 발현은 감소하였음, RAc1, OseEF1-a, OsUBQ5 유전자들이 대조군으로 사용되었음. WT, 야생형, g, 야생형 벼에서 추출한 genomic DNA. (B) RAmy1A의 상대적 발현량을 real-time PCR 분석 결과
표 japonica 및 indica 품종 모두에서 스트레스에 의해 증가하는 유전자의 heatmap. Heatmap 위의 패널은 비생물적 스트레스 유형을 나타내며, 삽입된 숫자는 스트레스/대조군의 수를 나타냄
표 과발현 계통을 이용한 OsWYRKY71에 의한 저온 스트레스 반응
표 대량고속 이미지 분석에 기초한 OsSta2-Ox 내건성 표현체 연구

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