초록 ▼

연구의 목적 및 내용
알츠하이머병(AD)의 정확한 진단, 조기 발견 그리고 신약 치료 효과에 대한 실시간 모니터링을 위해 AD 병리 특이적인 바이오마커가 필요함. 본 연구에서는 비침습적 AD 진단을 목표로, 방사성핵종을 대체할 수 있는 분자추적자로 근적외선 형광 분자추적자를 이용하고자 하며, 또한 AD 초기 병리의 특징 중 하나인 섬유성 타우 단백질과 선택적으로 결합하여 형광을 나타내는 물질을 개발하고자 함.

본 연구에서는 커큐민 유도체의 라이브러리 구축 및 활성-물성 최적화 연구를 통하여 섬유성 타우 단백질과 선

연구의 목적 및 내용
알츠하이머병(AD)의 정확한 진단, 조기 발견 그리고 신약 치료 효과에 대한 실시간 모니터링을 위해 AD 병리 특이적인 바이오마커가 필요함. 본 연구에서는 비침습적 AD 진단을 목표로, 방사성핵종을 대체할 수 있는 분자추적자로 근적외선 형광 분자추적자를 이용하고자 하며, 또한 AD 초기 병리의 특징 중 하나인 섬유성 타우 단백질과 선택적으로 결합하여 형광을 나타내는 물질을 개발하고자 함.

본 연구에서는 커큐민 유도체의 라이브러리 구축 및 활성-물성 최적화 연구를 통하여 섬유성 타우 단백질과 선택적으로 결합하여 근적외선 형광을 방출하는 커큐민 유도체를 개발하고자 함

구체적으로는,
1. 선행연구 결과 그 유의성이 입증된, molecular rotor 개념이 도입된 커큐민 유도체의 라이브러리를 구축하고,

2. In vitro tau filamentation assay 및 cell-based tau binding assay 등을 통하여 섬유성 타우 단백질과 선택적으로 결합하면서 근적외선 파장영역에서 형광을 방출하는 커큐민 유도체를 발굴하고,

3. 이 물질의 구조 집중 라이브러리 구축 및 섬유성 타우 선택적 결합능, 근적외선 영역 (700 ~ 900 nm) 형광, 물리화학적 성질(용해도, 막투과율, 안정성, 대사도), BBB 투과율, 생체이용률 등의 특성을 최적화함으로써, 궁극적으로 섬유성 타우 단백질과 선택적으로 결합하는 커큐민 유도체를 in vivo 근적외선 뇌 형광영상에 이용할 수 있는 형광 분자추적자로 개발하고자 함

연구개발성과
본 연구에서는 섬유성 타우 단백질과 선택적으로 결합하는 스마트 근적외선형광 탐침자를 개발하기 위하여,
1. 커큐민에서 유래한 3,5-dimethoxy-N,N-dimethylaniline-4-yl core scaffold와 DANIR-2c/MCAAD-3 등과 같은 smart NIRF Aβ probe의 특징적 donor-π-acceptor 구조를 적절히 접합한 신규 분자추적자를 합성하였다. 이 물질들은 free한 형태에서는 매우 약한 형광을 보이나 tau aggregate와 섬유화된 Aβ에 결합함으로써 근적외선 영역에서 강한 형광을 나타내는 특성을 보였다(λ_em = 650 nm, Stokes shifts = 70-110 nm). 특히, 3,5-dimethoxy-N,N-dimethylanilin-4-yl 구조와 MCAAD-3의 donor part를 접합한 유도체들은 Aβ 대비 3.8~5.7 배의 높은 섬유성 타우 단백질 선택성을 보였다.

즉, 이 신규 유도체들은 free한 상태와 비교할 때, 섬유성 타우 단백질과 결합시 49~108배의 형광강도 증가를 보인데 비해 Aβ fibril과 결합시에는 9~28배 정도밖에는 형광 세기의 증가를 보이지 않았다.

2. 또한, 커큐민 유래 형광 Aβ 탐침자인 CRANAD-2의 구조에 π-접합 링커를 도입한 연장 구조도 고안하여, 근적외선형광 스마트 탐침자를 사용 시 타우 섬유단백질과 효과적으로 결합할 뿐 아니라 완전한 근적외선 영역의 형광(λ_em = 720 nm, Stokes shifts = 150 nm)을 가지고 있어 타우 섬유단백질과 결합 시 형광의 세기가 79배 증가하며, 섬유화된 베타아밀로이드와 소혈청 알부민과 결합 시와 비교할 때 각각 14배 및 7.2배에 달하는 형광 강도의 증가를 보여 매우 우수한 타우 선별성을 보이고 있어, 근적외선형광 스마트 탐침자로서 알츠하이머병을 조기에 진단할 수 있음을 보였다.

이러한 섬유성 타우 단백질 선택성은 신규 유도체가 갖는 molecular-rotor-like property에 기인하는 것으로 이해된다. 놀랍게도, 알츠하이머병 환자의 human brain section에 대한 염색실험 결과, 섬유성 타우 단백질 선택성을 보이는 근적외선 형광 탐침자들은 타우 단백질 항체와 같은 위치에 colocalize된 것을 관찰할 수 있었는데, 이 결과는 in vitro 뿐만 아니라, ex vivo 환경에서도 신규 유도체의 섬유성 타우 단백질 선택성을 입증한 결과라 할 수 있다.

연구개발성과의 활용계획(기대효과)
1. Florbetapir (Amyvid)의 등장은 임상현장에서 비침습적인 방법으로 PET영상을 통해 AD 진단을 수행할 수 있음을 의미하지만, 국내에서 이 방사성추적자를 들여와 사용할 경우 고비용의 특허료와 가격을 지불해야 하는 실정임. 따라서 비방사능 분자추적자 개발에 의한 경제적인 새로운 AD 조기진단법의 개발은 보편적 의료서비스의 제공은 물론 자주적 보건의료체계 확립에 기여할 것임

2. 형광영상법은 방사성 핵종을 이용하지 않으므로 안전하고 장시간 scan이 가능하며, 그리고 무엇보다도 아주 경제적인 진단법이므로 전 국민을 대상으로 하는 치매 조기 진단 프로그램을 구성하는 데 있어 매우 적절한 방법이 될 것임

3. 형광영상에 응용될 분자추적자의 개발 연구는 현재 전 세계적으로도 연구개발의 초기에 해당하므로 선진국과의 기술격차가 크지 않아 선제적 연구활동에 의해 기술우위를 점할 수 있는 분야임

4. 본 연구과제의 분자추적자가 표적하는 AD 병리 특이적 표적은 치료제 개발의 표적이기도 함. 따라서 분자표적자를 이용한, 섬유성 타우 단백질 형성 저해 기전의 신규물질 유효성 검증법(in vitro assay, cell-based assay 및 animal study) 개발 및 원천기술 획득이 기대됨

(출처 : 요약문 4p)

Abstract ▼

Purpose&Contents
Alzheimer’s disease (AD) is characterized by two pathological hallmarks, β-amyloid (Aβ) plaques and neurofibrillary tangles (NFTs) composed of aggregated tau proteins, which are being investigated as biomarkers for non-invasive diagnosis of AD. Unlike Aβ plaques, NFTs have shown

Purpose&Contents
Alzheimer’s disease (AD) is characterized by two pathological hallmarks, β-amyloid (Aβ) plaques and neurofibrillary tangles (NFTs) composed of aggregated tau proteins, which are being investigated as biomarkers for non-invasive diagnosis of AD. Unlike Aβ plaques, NFTs have shown a significant correlation with the degree of cognitive impairment, and tau imaging has recently been reported as a more robust predictor of AD progression than Aβ imaging. Also, as the currently available positron emission tomography (PET) imaging has several problems associated with the use of radioactive tracers. we intended to develop optical imaging methods selectively detecting tau fibrils in human brains.

Results
1. Design of the novel smart NIRF tau tracers: development of a novel tau-selective smart NIRF probe was attempted through combination of the previously identified core scaffold, 3,5-dimethoxy-N,N-dimethylanilin-4-yl moiety, with the characteristic donor-π-acceptor architecture of smart NIRF Aβ probes.

2. Fluorescence of the synthesized probes in PBS: In the absence and presence of the preaggregated tau proteins, fluorescence of the synthesized probe molecules (50 μM) were examined in PBS.

3. Detection of the tau aggregates by the probes in SHSY-5Y cells: SHSY-5Y human neuroblastoma cells were transfected with pCMV6-htau40-GFP with TransIT-LT1. After 72 h, the cells were treated with the probes (5 μM) for 5 min and washed 3 times with medium. The cells were then observed in a confocal microscope at 520 nm for GFP and at 650 nm for the probes.

4. Fluorescence imaging of p-Tau in human AD brain sections: In order to examine the colocalization of tau probes with p-tau in human normal and AD brains, paraffin-embedded sections were deparaffinized and dehydrated through a series of ethanol. The tissue slides were incubated for 1 h in a blocking solution and then incubated with p-tau (S202/T205) antibody (Phospho-PHF-tau pSer202+Thr205 antibody) at 4 °C overnight. After washing in TBS 2 times, sections were incubated for 1 h with a fluorescent-conjugated secondary antibody [Alexa Fluor 488 conjugated goat secondary antibody to rabbit IgG]. The slides were washed with TBS 3 times.

Next, the tissue slides were treated with the probes (5 μM) for 30 min and washed with TBS 3 times. The fluorescence signals were visualized using a confocal microscope.

Development of a novel, tau-selective smart near-infrared fluorescence (NIRF) probe was attempted by combining the previously identified core scaffold 3,5-dimethoxy-N,N-dimethylaniline-4-yl moiety, with the characteristic donor-π-acceptor architecture of the smart NIRF Aβ probes DANIR-2c and MCAAD-3. A series of compounds were prepared, which were identified as "turn-on" NIRF probes for the visual detection of tau aggregates and Aβ fibrils (λem = 650 nm, Stokes shifts = 70-110 nm). In particular, combination of the 3,5-dimethoxy-N,N-dimethylanilin-4-yl moiety and the donor part of MCAAD-3 endowed the resulting probes with significant selectivity toward tau aggregates (selectivity for tau over Aβ = 5.7 and 3.8); they showed much higher fluorescence intensities upon binding to tau aggregates (FItau = 49 and 108) than when bound to Aβ fibrils (FIAβ = 9 and 28). Quantitative analysis of binding affinities and fluorescence properties of the probes revealed that microenvironment-sensitive molecular rotor-like behavior, rather than binding affinity to the target, is responsible for their selective turn-on fluorescence detection of tau fibrils.

Selective fluorescent labeling of tau fibrils by the probes was further demonstrated by immunofluorescence staining of human Alzheimer's disease brain sections, which showed colocalization of the probes and phosphorylated tau antibody.

Expected Contribution
1. NIRF imaging is a safe and economic imaging technique which can be used for nationwide campaign for early diagnosis of AD.

2. Development of tau-selective smart NIRF probes is a newly emerging field of research. Therefore, global competition is relatively weak and there is enough chance for us to lead the market by the ground-breaking idea.

3. Tau is a key pathological hallmakr of AD for both diagnosis and treatment of AD.
Therefore, NIRF detection of tau fibrils can lead to development of novel in vitro assay, cell-based assay, and in vivo assay for development of anti-AD agents.

(출처 : SUMMARY 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 국문 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 5
• 목차 ... 6
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 7
• 1-1. 연구개발 목적 ... 7
• 1-2. 연구개발의 필요성 ... 7
• 1-3. 연구개발 범위 ... 10
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 12
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 18
• 3.1 연구개발 실적 1 ... 18
• 3.2 연구개발 실적 2 ... 23
• 3.3 연구개발 실적 3 ... 24
• 3.4 연구개발 실적 4 ... 27
• 3.5 연구개발 실적 5 ... 33
• 3.6 연구개발 실적 6 ... 37
• 3.7 연구개발 실적 7 ... 44
• 4. 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 48
• 4-1. 목표달성도 ... 48
• 4-2. 관련분야 기여도 ... 48
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 49
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 50
• 7. 연구개발성과의 보안등급 ... 50
• 8. 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비 현황: ... 50
• 9. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 51
• 10. 연구개발과제의 대표적 연구실적 ... 52
• 11. 기타사항 ... 53
• 12. 참고문헌 ... 53
• 별첨: 실적 증빙자료 ... 54
• 별첨: 기타 첨부서류 ... 60
• 끝페이지 ... 84