[보고서]식품 등의 의도적 사용물질에 대한 내분비계 활성 평가 연구 -동물용의약품 중심으로-

구용의

식품 등의 의도적 사용물질에 대한 내분비계 활성 평가 연구 -동물용의약품 중심으로-
Assessment of human estrogen/androgen receptor agonistic/antagonistic effects on veterinary drugs by OECD in vitro assays 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	식품의약품안전평가원 National Institute of Food and Drug Safety Evaluation
연구책임자	구용의
참여연구자	홍진환 , 오현숙 , 이희석 , 김나연 , 송영선 , 정정호 , 오경용
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2018-12
과제시작연도	2018
주관부처	식품의약품안전처 Ministry of Food and Drug Safety
등록번호	TRKO201900003439
과제고유번호	1475010562
사업명	식품등안전관리(R&D)
DB 구축일자	2019-07-13
키워드	내분비계장애물질 검색시험법.에스트로겐성.안드로겐성.동물용의약품.S9 대사체.in vitro.Estrogenic.Androgenic.Veterinary drugs.S9 fraction.
DOI	https://doi.org/10.23000/TRKO201900003439

초록 ▼

OECD는 화학물질의 내분비계에 미치는 영향을 보다 정확하게 검색하기 위해 국제적으로 표준화된 검색 시험법을 마련하고 있으며, 최근에는 시험비용 절감과 실험동물에 대한 윤리적 문제를 해결하고자 세포주 이용 시험법 개발에 힘쓰고 있다. 특히 OECD에서는 in vitro 시험법을 통한 내분비계 활성 검색시 대상물질이 체내에서 생성될 수 있는 대사체들에 대한 중요성을 강조하고 있으나 아직까지 in vitro 시험법에서의 대사체들에 대한 연구는 한계점이 존재한다. 이에 본 과제에서는 세포주 이용 OECD 내분비계 장애물질 검색시험법과 S9 fraction 시스템을 활용하여 국내 잔류기준 설정 동물용의약품 200여종 중 인체 에스트로겐 수용체(ER) agonist/antagonist로 판정된 물질 4종과 인체 안드로겐 수용체(AR) agonist/antagonist로 판정된 물질 14종의 대사체들에 대한 활성을 비교 평가하고 작용기전을 탐색하고자 하였다. 시험물질과 S9 fraction을 세포배양 조건에서 동시처리하여 활성의 차이를 측정하였다. 에스트로겐 활성 평가 대상물질 4종 중 모물질 대비 대사체의 활성이 증가한 경우는 인체자궁경부암세포주 이용시험법에서 2종(Agonist: Trenbolone, Nandrolone)이 확인되었다. 안드로겐 활성 평가 대상 물질 14종 중 모물질 대비 대사체의 활성이 증가한 경우는 인체전립선암세포주 이용 시험법에서 2종(Antagonist: Bithionol, Diclazuril)이며 활성이 감소한 경우는 햄스터난소세포주 이용 시험법에서 3종(Antagonist: Tetracycline, Zeranol, Isoeugenol), 인체전립선암세포주 이용 시험법에서 1종(Antagonist: Zeranol)이 확인되었다. 인체유방암세포주와 인체전립선암세포주를 이용한 ER/AR agonist의 에스트로겐성/안드로겐성 관련 활성 기전을 탐색한 결과에서는 MAP kinase family 중 ERK activation에 관여하는 것을 확인하였다. 이를 통해 ER/AR agonist에 의해 발생되는 호르몬 교란 작용에 ERK protein이 관여하는 것으로 판단된다. 본 연구는 세포주 이용 OECD 내분비계 장애물질 검색시험법과 S9 fraction을 접목시켜 동물용의약품의 활성을 1차 screening한 결과로서, 보다 확실한 영향평가는 동물실험 등 추가실험이 필요하지만 본 연구결과는 향후 국내 식·의약품 및 화장품 원료물의 내분비계 관련 안전 관리를 위한 활성예측시스템 구축 등을 위한 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 관련 정부기관 및 산․학․연으로의 기술 보급을 위해 실습워크숍 개최 및 방문 교육 등을 실시하였다.

(출처 : 요약문 2p)

Abstract ▼

Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) provides an international standardized method the search the effect of chemicals on the endocrine system. Lately, in vitro assays became an issue because the cost is lower and the ethical aspects of animal experimentation are problem. In particular, OECD emphasizes the importance of metabolites of target substances that can be produced in the body when the endocrine activity is searched through in vitro assay. However, there is still a limit to the study of metabolites in in vitro assay. In this study, OECD endocrine disrupter detection test method using cell line and S9 fraction system were utilized. We selected 4 substances identified as human estrogen receptor (ER) agonist/antagonist and 14 substances identified as human androgen receptor (AR) agonist/antagonist among over 200 veterinary drugs. And we compared and evaluated the activity of their metabolites and investigated its mechanism of action. The test substances and S9 fraction were treated simultaneously under cell culture conditions to determine the difference in activity. 2 test substances (Agonist: Trenbolone, Nandrolone) among 4 estrogen activity evaluation substances increased the activity of its metabolites in human cervical cancer cell line assay.
Among the 14 androgen activity evaluation substances, 2 test substances (Antagonist: Bithionol, Diclazuril) increased activity of its metabolites in human prostate cancer cell line assay. Also, 3 test substances (Antagonist: Tetracycline, Zeranol, Isoeugenol) reduced activity of its metabolites reduced in the hamster ovary cell line assay, and 1 test substance (Antagonist: Zeranol) reduced activity of its metabolites reduced in the human prostate cell line assay. We have investigated the estrogen/androgen related activation mechanism of ER/AR agonist using human breast cancer cell line and human prostate cancer cell line, and confirmed that it is involved in ERK activation among MAP kinase family. This suggests that the ERK protein participates in the hormonal disturbance produced by the ER/AR agonist. This study was the first result of screening the activity of veterinary drugs by combining OECD endocrine disrupter detection test method using cell line with S9 fraction system, based on this, it is expected that it will be used as basic data for the future establishment of an activity prediction system for the safety management of the endocrine system of food, drug, and cosmetic ingredients. Also, we held practical training workshop and educational visits to spread technology.

(출처 : Summary 3p)

목차 Contents

표지 ... 1
국문 요약문 ... 2
Summary ... 3
목차 ... 4
제1장 연구개발과제의 개요 ... 5
제1절 연구개발과제의 목표 ... 5
제2절 연구개발과제의 필요성 ... 5
제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 9
제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 12
제4장 연구결과 고찰 및 결론 ... 135
제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 139
제6장 연구개발과제 연구개발 결과 활용계획 ... 140
제1절 활용성과 ... 140
제7장 참고문헌 ... 142
제8장 첨부서류 ... 144
끝페이지 ... 145

표/그림 (140)

표 내분비계장애물질(환경호르몬)에 의한 피해로 추정되는 주요 사례
표 전문가 그룹 구성을 통한 시험지침의 개발 및 국제 표준화 추진
표 내분비계장애물질에 대한 연구활동 증가
표 OECD 내분비계장애추정물질 검색시험법 마련을 위한 체계도
표 독성시험법 마련 현황(OECD)
표 추진 중인 국제 검색시험법(OECD)
표 OECD 내분비계장애추정물질 국제검증연구 참여 현황
표 식약처의 OECD 내분비계장애추정물질 검색시험법 국제검증연구 참여 현황
표 연구 추진 전략 및 체계도
표 LC-MS/MS를 통한 대사체 profiling 방법
표 에스트로겐 수용체(-α, β) 경쟁적 결합반응시험법의 원리
표 사용 제품의 구성 및 보관
표 분석 well의 수에 따른 2× Fluormone ES2/ERα 혼합 관정 예시
표 분석 대상 시험물질의 microtiter plate 구성 예시
표 에스트로겐 수용체(-α, β) 경쟁적 결합반응시험법의 판정 기준
표 OECD TG455 STTA assay 실험 과정
표 OECD TG455 STTA assay 요약(agonist test) antagonist 내용은 없는지?
표 1.5 mL PP tube에서 표준물질의 희석 과정
표 log PC50 계산 예시
표 OECD PBTG455 STTA assay의 수행 기준 및 양성 판정 기준
표 OECD PBTG455 VM7Luc ER TA assay 원리
표 E2의 희석 과정
표 E2 reference standard dosing solution 준비 과정
표 Visual Observation Scoring 기준
표 log PC50 계산 예시
표 log IC30 계산 예시
표 OECD PBTG 455 VM7Luc ER TA assay의 수행 기준 및 판정 기준
표 안드로겐 수용체 결합반응 시험법 원리
표 제품의 구성 및 보관
표 분석 well의 수에 따른 2X Fluormone AL Green/AR 혼합 관정 예시
표 분석 대상 시험물질의 microtiter plate 구성 예시
표 안드로겐 수용체 경쟁적 결합반응시험법의 판정 기준
표 햄스터난소세포주 이용 안드로겐 수용체 전사활성시험법 원리
표 희석 용액의 제작 plate 예시(Agonist)
표 희석 용액의 제작 plate 예시 (Antagonist)
표 시험 물질 및 대조 물질 첨가 예시 (Agonist)
표 시험 물질 및 대조 물질 첨가 예시 (Antagonist)
표 log PC50 계산 예시
표 log IC30 계산 예시
표 햄스터난소세포주 이용 안드로겐성 검색시험법의 수행 기준 및 판정 기준
표 용해도 실험의 순서도
표 Agonist assay의 분석 plate 예시
표 Antagonist assay의 분석 plate 예시
표 log PC50 계산 예시
표 log IC50 계산 예시
표 인체전립선암세포주 이용 안드로겐성 검색시험법의 수행 기준 – agonist assay
표 인체전립선암세포주 이용 안드로겐성 검색시험법의 수행 기준 – antagonist assay
표 인체전립선암세포주 이용 안드로겐성 검색시험법의 양성 판정 기준
표 10× Human/Rat S9 mix의 구성 및 농도
표 인체자궁경부암세포주 에스트로겐 수용체전사활성시험법의동시처리 분석 plate – Agonist assay
표 인체자궁경부암세포주에스트로겐수용체전사활성시험법의동시처리분석 plate – Antagonist assay
표 인체유방암세포주 에스트로겐 수용체 전사활성시험법의 동시처리 분석 plate – Agonist assay
표 인체유방암세포주 에스트로겐 수용체 전사활성시험법의 동시처리 분석 plate – Antagonist assay
표 햄스터난소세포주 안드로겐 수용체 전사활성시험법의 동시처리 분석 plate – Agonist assay
표 햄스터난소세포주 안드로겐 수용체 전사활성시험법의 동시처리 분석 plate – Antagonist assay
표 인체전립선암세포주 안드로겐 수용체 전사활성시험법의 동시처리 분석 plate – Agonist assay
표 인체전립선암세포주 안드로겐 수용체 전사활성시험법의 동시처리 분석 plate – Antagonist assay
표 인체유방암세포주의 주요 에스트로겐 수용체 agonist 활성 기전
표 인체전립선암세포주의 주요 안드로겐 수용체 agonist 활성 기전
표 평가대상 동물용의약품 선정 결과
표 수용체 결합 및 transcription activity를 동시에 만족하는 평가대상물질 선정
표 에스트로겐, 안드로겐 활성 평가 대상 동물용의약품 15종
$HPLC분석을 통한 동물용의약품 S9 fraction 대사율 분석$ 표 HPLC분석을 통한 동물용의약품 S9 fraction 대사율 분석
표 Oxytetracycline(좌)과 Tetracycline(우)의 LC-MS/MS Extracted Ion Chromatogram (Oxytetracycline과 Tetracycline의 Standard는 50% ACN에 희석하여 관찰)
표 Bithionol(좌)과 Cymiazole(우)의 LC-MS/MS Extracted Ion Chromatogram (Bithionol과 Cymiazole의 Standard는 50% ACN에 희석하여 관찰)
표 Diclazuril(좌)과 Toltrazuril(우)의 LC-MS/MS Extracted Ion Chromatogram (Diclazuril과 Toltrazuril의 Standard는 50% ACN에 희석하여 관찰)
표 Dexamethasone(좌)과 Trenbolone(우)의 LC-MS/MS Extracted Ion Chromatogram (Dexamethasone과 Trenbolone의 Standard는 50% ACN에 희석하여 관찰)
표 Zeranol(좌)과 Phenothiazine(우)의 LC-MS/MS Extracted Ion Chromatogram (Zeranol과 Phenothiazine의 Standard는 50% ACN에 희석하여 관찰)
표 Altrenogest(좌)와 Nandrolone(우)의 LC-MS/MS Extracted Ion Chromatogram (Altrenogest와 Nandrolone의 Standard는 50% ACN에 희석하여 관찰)
표 Tetrachlorvinphos의 LC-MS/MS basepeak chromatogram (Tetrachlorvinphos의 Standard는 50% ACN에 희석하여 관찰)
$Human S9 fraction과 반응시킨 Oxytetracycline의 PCA 결과$ 표 Human S9 fraction과 반응시킨 Oxytetracycline의 PCA 결과
$Human S9 fraction과 반응시킨 Tetracycline의 PCA 결과$ 표 Human S9 fraction과 반응시킨 Tetracycline의 PCA 결과
$Human S9 fraction과 반응시킨 Bithionol의 PCA 결과$ 표 Human S9 fraction과 반응시킨 Bithionol의 PCA 결과
$Human S9 fraction과 반응시킨 Cymiazole의 PCA 결과$ 표 Human S9 fraction과 반응시킨 Cymiazole의 PCA 결과
$Human S9 fraction과 반응시킨 Diclazuril의 PCA 결과$ 표 Human S9 fraction과 반응시킨 Diclazuril의 PCA 결과
$Human S9 fraction과 반응시킨 Toltrazuril의 PCA 결과$ 표 Human S9 fraction과 반응시킨 Toltrazuril의 PCA 결과
$Human S9 fraction과 반응시킨 Dexamethasone의 PCA 결과$ 표 Human S9 fraction과 반응시킨 Dexamethasone의 PCA 결과
$Human S9 fraction과 반응시킨 Trenbolone의 PCA 결과$ 표 Human S9 fraction과 반응시킨 Trenbolone의 PCA 결과
$Human S9 fraction과 반응시킨 Zeranol의 PCA 결과$ 표 Human S9 fraction과 반응시킨 Zeranol의 PCA 결과
$Human S9 fraction과 반응시킨 Phenothiazine의 PCA 결과$ 표 Human S9 fraction과 반응시킨 Phenothiazine의 PCA 결과
$Human S9 fraction과 반응시킨 Altrenogest의 PCA 결과$ 표 Human S9 fraction과 반응시킨 Altrenogest의 PCA 결과
$Human S9 fraction과 반응시킨 Nandrolone의 PCA 결과$ 표 Human S9 fraction과 반응시킨 Nandrolone의 PCA 결과
$Human S9 fraction과 반응시킨 Tetrachlorvinphos의 PCA 결과$ 표 Human S9 fraction과 반응시킨 Tetrachlorvinphos의 PCA 결과
표 Cymiazole 유래 활성 대사체 후보물질(m/z 205)의 fragmentary pattern
표 Cymiazole 유래 활성 대사체 후보물질(m/z 205)의 예상구조
표 Cymiazole 유래 활성 대사체 후보물질(m/z 235)의 MS1 peak과 예상구조
표 Trenbolone 유래 활성 대사체 후보물질(m/z 257)의 fragmentary pattern
표 Trenbolone 유래 활성 대사체 후보물질(m/z 257)의 예상구조
표 Trenbolone 유래 활성 대사체 후보물질(m/z 269)의 MS1 peak과 예상구조
표 Zeranol 유래 활성 대사체 후보물질(m/z 307)의 fragmentary pattern
표 Zeranol 유래 활성 대사체 후보물질(m/z 307)의 예상구조
표 Zeranol 유래 활성 대사체 후보물질(m/z 339)의 MS1 peak과 예상구조
표 Altrenogest 유래 활성 대사체 후보물질(m/z 297)의 fragmentary pattern
표 Altrenogest 유래 활성 대사체 후보물질(m/z 297)의 예상구조
표 Altrenogest 유래 활성 대사체 후보물질(m/z 327)의 MS1 peak과 예상구조
표 OECD PBTG455 HeLa9903 STTA 에스트로겐 활성 결과(선처리)
표 OECD PBTG455 HeLa9903 STTA 에스트로겐 활성 결과(선처리)
표 OECD PBTG455 HeLa9903 STTA 항에스트로겐 활성 결과(선처리)
표 OECD PBTG455 HeLa9903 STTA 항에스트로겐 활성 결과(선처리)
표 OECD PBTG455 HeLa9903 STTA 에스트로겐 활성 결과(동시처리)
표 OECD PBTG455 HeLa9903 STTA 에스트로겐 활성 결과(동시처리)
표 OECD PBTG455 HeLa9903 STTA 항에스트로겐 활성 결과(동시처리)
표 OECD PBTG455 HeLa9903 STTA 항에스트로겐 활성 결과(동시처리)
표 OECD PBTG455 VM7Luc4E2 ER TA 에스트로겐 활성 결과(선처리)
표 OECD PBTG455 VM7Luc4E2 ER TA 에스트로겐 활성 결과(선처리)
표 OECD PBTG455 VM7Luc4E2 ER TA 항에스트로겐 활성 결과(선처리)
표 OECD PBTG455 VM7Luc4E2 ER TA 항에스트로겐 활성 결과(선처리)
표 OECD PBTG455 VM7Luc4E2 ER TA 에스트로겐 활성 결과(동시처리)
표 OECD PBTG455 VM7Luc4E2 ER TA 에스트로겐 활성 결과(동시처리)
표 OECD PBTG455 VM7Luc4E2 ER TA 항에스트로겐 활성 결과(동시처리)
표 OECD PBTG455 VM7Luc4E2 ER TA 항에스트로겐 활성 결과(동시처리)
표 동물용의약품 및 그 대사체의 에스트로겐 수용체-α 결합반응 시험법 결과
표 동물용의약품성분 및 그 대사체의 에스트로겐 수용체-α 결합반응 시험법 결과
표 OECD TG458 AR Ecoscreen 안드로겐 활성 결과(선처리)
표 OECD TG458 AR Ecoscreen 안드로겐 활성 결과(선처리)
표 OECD TG458 AR Ecoscreen 항안드로겐 활성 결과(선처리)
표 OECD TG458 AR Ecoscreen 항안드로겐 활성 결과(선처리)
표 OECD TG458 AR Ecoscreen 안드로겐 활성 결과(동시처리)
표 OECD TG458 AR Ecoscreen 안드로겐 활성 결과(동시처리)
표 OECD TG458 AR Ecoscreen 항안드로겐 활성 결과(동시처리)
표 OECD TG458 AR Ecoscreen 항안드로겐 활성 결과(동시처리)
표 22Rv1/MMTV_GR-KO 안드로겐 활성 결과(선처리)
표 22Rv1/MMTV_GR-KO 안드로겐 활성 결과(선처리)
표 22Rv1/MMTV_GR-KO 항안드로겐 활성 결과(선처리)
표 22Rv1/MMTV_GR-KO 항안드로겐 활성 결과(선처리) - Human
표 22Rv1/MMTV_GR-KO 항안드로겐 활성 결과(선처리) - Rat
표 22Rv1/MMTV_GR-KO 안드로겐 활성 결과(동시처리)
표 22Rv1/MMTV_GR-KO 안드로겐 활성 결과(동시처리)
표 22Rv1/MMTV_GR-KO 항안드로겐 활성 결과(동시처리)
표 22Rv1/MMTV_GR-KO 항안드로겐 활성 결과(동시처리) - Human
표 22Rv1/MMTV_GR-KO 항안드로겐 활성 결과(동시처리) - Rat
표 동물용의약품 및 그 대사체의 안드로겐 결합반응 시험법 결과
표 동물용의약품 및 그 대사체의 안드로겐 수용체 결합반응 시험법 결과
표 동물용의약품 3종의 인체유방암세포주 내 활성 기전 결과
표 동물용의약품 3종의 인체유방암세포주 이용 에스트로겐 활성 기전 확인
표 동물용의약품 3종의 인체전립선암세포주 이용 안드로겐 활성 기전 확인
표 S9 선처리 방법을 이용한 시험법의 한계점
표 DMSO(Vehicle) S9 단독처리시 활성곡선의 변화
표 동물용의약품 15종의 모물질 대비 대사체 활성 비교 결과
표 동물용의약품의 에스트로겐/안드로겐의 agonistic 활성 기전 확인 결과

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