초록 ▼

유전자치료제는 난치성 유전질환에 대한 궁극적 치료법으로 국내·외 많은 글로벌 제약사 및 벤처 기업에서 활발히 개발·연구되고 있음

최근 바이러스 벡터 기반으로 유전자를 도입시키는 유전자치료제의 안전성 및 품질관리의 중요성이 강조되고 있으며, 유전자교정을 이용한 유전자치료 기술 활용으로 제품 개발이 가속화 될 것으로 예상되어 이에 대응한 과학적 품질 및 안전성·유효성 평가 기준 및 평가기술 개발이 필요함

제1세부 요약
유전자치료제 중 복제가능한 oncolytic HSV-1 (oHSV)에 대해 sheddin

유전자치료제는 난치성 유전질환에 대한 궁극적 치료법으로 국내·외 많은 글로벌 제약사 및 벤처 기업에서 활발히 개발·연구되고 있음

최근 바이러스 벡터 기반으로 유전자를 도입시키는 유전자치료제의 안전성 및 품질관리의 중요성이 강조되고 있으며, 유전자교정을 이용한 유전자치료 기술 활용으로 제품 개발이 가속화 될 것으로 예상되어 이에 대응한 과학적 품질 및 안전성·유효성 평가 기준 및 평가기술 개발이 필요함

제1세부 요약
유전자치료제 중 복제가능한 oncolytic HSV-1 (oHSV)에 대해 shedding 및 germline transmission을 평가법을 개발하고 표준화하였음. 먼저 복제가능한 oHSV의 고농도, 고순도 생산 기법을 확립하였으며 동물실험에 사용될 수 있도록 대량생산을 수행하였음. 암세포에서 복제되는 oHSV의 특징을 감안하여 기존에 많은 연구가 수행된 AAV를 평가법에 대한 양성대조군으로 설정하였음. 바이러스 벡터의 shedding은 정량 PCR기법과 plaque assay 기법을 활용하여 평가법을 개발하고 중동물인 토끼 모델에서의 실험을 통해 평가법을 검증하였음. 바이러스 벡터의 germline transmission은 정량 PCR기법과 면역염색법을 활용하여 평가법을 개발하고 소동물인 마우스 모델에서 실험을 통해 평가법을 검증하였음. 궁극적으로 검증과정을 거쳐 총 7종의 SOP를 확립하였음.

제2세부 요약
유전자치료제 벡터로 많은 장점을 가진 렌티바이러스 벡터의 GMP 제조공정을 고려하여 원료에서부터 완제품까지 안전성과 유효성 면에서 분석을 해야 하는 분석법을 개발하고 밸리데이션을 통해 표준화 SOPs 9종을 확립하였음. 렌티바이러스 생산용 플라스미드 identification 분석법, 바이러스 벡터의 정량분석법으로 Transduction unit titer assay by proviral DNA & CFU, Viral genome & particles 정량법으로 qRT-PCR & p24 ELISA 시험법을 확립함. 또한 Viral vector genome integrity & identification 분석법 완료. 완제품에 대한 분석시험법으로는 SV40 Large T antigen residual host cell protein 분석, Residual host cell DNA 분석법으로 E1a & SV40 Large T antigen, Residual Plasmid DNA 오염분석법으로는 LOD가 50~100 copies인 qPCR 분석법을 개발하여 밸리데이션 완료 후 SOPs 확립함. 가장 중요한 RCL 분석법은 LOD = 0.1 TU의 민감도 탁월한 사험법을 확립하였고, VSV-G 분석법도 100 copies의 우수한 민감도의 qPCR 분석법 확립함. 비바이러스성 electroporation 기반 유전자치료제는 주성분이 비바이러스 운반체인 플라스미드 DNA형태로 고효율 체내 전달법으로 전기천공(electroporation) 투여법을 이용함. 이미 국내외 다수의 전임상 및 임상연구결과 매우 안전함이 규명되었음. 또한, 품질평가기술은 이미 과년도 식약처연구과제를 통하여 시험법 개발이 완료되어, 유효성 평가와 상관성이 있고 전기천공 (electroporation) 투여가 적용가능하며, 기존 시험법 대비 개선이 필요한 생체내(in vivo) 역가가시험법의 개발 및 시험법 표준화를 완료함.

제3세부 요약
3세부에서는 CRISPR / Cas9 기법을 통해 두 가지 유전 마우스 모델, A형 혈우병 inversion 모델 및 노리병 모델을 성공적으로 생산하였으며 유전적으로 유도된 돌연변이 및 질병 표현형으로 모델을 검증하였음. AAV 표현형 분석은 AAV 게놈에 대한 정량 qPCR 및 AAV의 전신 주사 및 국소 주사를 통해 다양한 조직에서 AAV serotype-dependent 한 체내 발광 이미징에 의해 확립되었다. AAV 매개 게놈 편집의 치료 효능은 특히 안구 질환 모델 (LCA2)에서 효율적으로 나타났다. 본 세부과제는 유전자교정을 이용하여 두 가지 질환동물모델을 개발하고 정량 PCR 및 이미징 기법을 이용한 체내 분포 평가 기술을 확립하였음.

(출처 : 국문 요약문 7p)

Abstract ▼

Gene therapy is the ultimate treatment for intractable genetic diseases and is being actively developed and studied by many global pharmaceutical companies and venture companies in Korea and abroad.

Recently, the importance of safety and quality control of viral vector based gene therapy prod

Gene therapy is the ultimate treatment for intractable genetic diseases and is being actively developed and studied by many global pharmaceutical companies and venture companies in Korea and abroad.

Recently, the importance of safety and quality control of viral vector based gene therapy products has been emphasized, and gene therapy product development using genome editting technique is expected to be accelerated, so it is highly required to development of three major characterization of gene therapy in quality, safety and efficacy aspect.

The 1^st sub-Project
This study developed and standardized assessment of shedding and germline transmission for replicable oncolytic HSV-1 (oHSV) gene therapy products. We first established high-purity and high-concentration of oHSV production for animal study. Since oHSV hasbeen modified to replicate within tumors, we set out AAV2 as an experimental positivecontrol. The viral vector shedding was developed by quantitative PCR and plaque assaytechniques, and the evaluation method was verified by rabbit animal studies. Germline transmission of viral vector was developed using quantitative PCR and immunohistochemistry (IHC) techniques, and the methods was validated by mouse animal studies. Ultimately, we have established a total of seven SOPs through the verification process.

The 2^nd sub-Project
Lentivirus vector is well known and widely used for gene therapeutics, demanding GMP grade-mass production. Therefore, new and advanced testing methods are required to prove the safety and efficacy of final products as well as raw materials. Through the intensive works, the team developed testing methods, followed by establishing the validated 9 of SOPs. The details are 1) plasmid identification methods, 2) transduction unit titer assay by proviral DNA & CFU, 3) qRT-PCR & p24 ELISA to quantify viral genome& particles, 4) viral genome integrity & identification method, 5) SV40 Large T antigen detection to identify residual host cell protein, 6) E1a & SV40 Large T antigen assay for residual host cell DNA detection, 7) qPCR assays (LOD=50~100 copies) to identify residual plasmid DNA contaminations, 8) RCL (LOD=0.1TU) to detect replication competent viruses, and 9) qRT-PCR (LOD=100 copies) to detect VSV-G.

Gene therapy with non-viral vector generally uses plasmid DNA as main component and in vivo electroporation as high efficient gene delivery way. Lots of preclinical and clinicalstudies have shown good safety profiles of plasmid DNA and in vivo electroporation. The assays to evaluate the quality of plasmid DNA are also well developed and there was even the KMFDS funded research to develop the quality assays for plasmid DNA. In this research, we developed and qualified the potency assay of plasmid DNA gene therapy delivered by electroporation, which is relevant to efficacy and needs to be improved compared to original potent assay of plasmid DNA.

The 3^nd sub-Project
In this research, two genetic mouse model, hemophlia A-inversion and Norrie disease,were successfully generated through use of CRISPR/Cas9, and validated by genetically induced mutation and disease phenotype. Assays for AAV expression were established by qPCR quantification for AAV genome and in vivo luminescence imaging, which showed serotype-dependent kinetics in diverse tissues with systemic and local injections of AAVs.
Therapeutic efficacy of AAV-mediated genome editing was efficiently shown in one ocular disease model (LCA2). Taken together, the research suggests reliable methods to detect AAV biodistribution and potential application of genome editing for AAV gene therapy.

(출처 : SUMMARY 10p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 용역연구개발과제 최종보고서 ... 2
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• Ⅰ. 총괄연구개발과제 요약문 ... 7
• 국문 요약문 ... 7
• Summary ... 10
• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 13
• 제1장 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성 ... 13
• 제2장 총괄연구개발과제의 내용 및 방법 ... 70
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종결과 및 고찰 ... 73
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 76
• 제5장 총괄주요연구 변경사항 ... 79
• 제6장 총괄참고문헌 ... 79
• 제7장 총괄첨부서류 ... 79
• 제(1)세부연구개발과제 연구결과 ... 80
• 제1장 제(1)세부 연구개발과제 요약문 ... 81
• 제2장 세부연구개발과제의 목적 ... 84
• 제3장 제(1)세부연구개발과제의 내용 및 방법 ... 98
• 제4장 제(1)세부연구개발과제의 결과 및 고찰 ... 112
• 제5장 제(1)세부참고문헌 ... 180
• 제(2)세부연구개발과제 연구결과 ... 185
• 제1장 제(2)세부 연구개발과제 요약문 ... 186
• 제2장 2세부연구개발과제의 목적 ... 190
• 제5장 세부참고문헌 ... 311
• 제(3)세부연구개발과제 연구결과 ... 316
• 제1장 제(3)세부 연구개발과제 요약문 ... 317
• 제2장 제(3)세부연구개발과제의 목적 ... 320
• 제3장 제(3)세부연구개발과제의 내용 및 방법 ... 343
• 제4장 제(3)세부연구개발과제의 결과 및 고찰 ... 351
• 제5장 제(3)세부참고문헌 ... 392
• 제7장 총괄첨부서류 ... 393
• 끝페이지 ... 417