초록 ▼

본 연구과제는 동물유래 성분 배제 전분화능 줄기세포 배양을 통한 임상 활용 가능한 배양 조건 개발 및 품질시험법 개발을 목표로 하고 있으며, 크게 두 분류로 나누어 연구를 수행하였음.

첫 번째. 인간 전분화능줄기세포의 임상 수준 배양조건에서 장기배양에 따른 유전체 및 SNP 변화 분석을 통하여 다음과 같은 결과를 얻음.
1. 임상 적용 가능하면서 16 계대배양 미만인 인간 유도만능 줄기세포주 2종(iPSC-NT4와 iPSC-CMC)을 확보하고, 알려진 여러 xeno-free조건 중 vitronectin과 TeSR-

본 연구과제는 동물유래 성분 배제 전분화능 줄기세포 배양을 통한 임상 활용 가능한 배양 조건 개발 및 품질시험법 개발을 목표로 하고 있으며, 크게 두 분류로 나누어 연구를 수행하였음.

첫 번째. 인간 전분화능줄기세포의 임상 수준 배양조건에서 장기배양에 따른 유전체 및 SNP 변화 분석을 통하여 다음과 같은 결과를 얻음.
1. 임상 적용 가능하면서 16 계대배양 미만인 인간 유도만능 줄기세포주 2종(iPSC-NT4와 iPSC-CMC)을 확보하고, 알려진 여러 xeno-free조건 중 vitronectin과 TeSR-E8 배양액을 이용한 최적의 장기 배양조건 (0, 15, 30계대)을 확립함.
2. 배양된 세포를 이용하여 장기 계대배양 및 배양조건에 따른 SNP profiling 및 genomic alteration을 수행한 결과, 각 세포주별 약 400,000개 내외의 SNP 변이가 동정되었으며 세포주 및 계대에 따라 약 155-490개의 유전체 변이가 관찰되었음.
3. 임상 수준의 배양조건에서 장기배양 후, mRNA-Seq 분석을 통해 유전자 발현변화의 DB구축하였고, 유전체 데이터 통합분석을 통해 장기 계대 배양 시 iPSC-NT4와 iPSC-CMC는 증식이 느려지고 자연분화가 증가하며 배양 접시에 부착하여 자라지 못하고 떨어져 사멸하는 양상을 보임.

두 번째. 임상 수준 장기배양 후 생산된 SNP 발현변화 DB를 분석하고, 임상용 전분화능 줄기세포의 분화유도를 통한 분화능 검증.
1. 장기 배양 후 발생된 각 세포주의 시그너처를 동정하고, 줄기세포 주요기능 관련 유전자 발현 네트워크(삼배엽 분화능, 종양원성, 면역거부반응 관련 유전자)를 분석하고 표지인자들을 규명하였음.
2. 또한 장기배양에 따른 줄기세포의 분화능 (중배엽세포, 조혈모세포, 폐상피세포, 혈관내피세포, 신경전구세포)을 평가한 결과, 분화능에 대한 유의적인 차이점은 발견되지 않음.
3. 비록 분화능의 평가에서는 큰 차이점을 발견하지 못하였으나, 초기 유전체 분석에서 장기 배양 시 증식 관련 유전자 감소와 대사 관련 유전자 발현 증가가 관찰되었음.(수정함) 결과적으로 세포가 스트레스를 받는 상황으로 가고 있다는 것을 확인함. 이를 기반으로 장기 배양 시 발생하는 손상을 예방할 수 있는 배양 첨가제의 필요성이 대두됨. 스트레스를 저감하는 첨가제를 처리한 전분화능 줄기세포의 최적장기배양 조건 및 품질시험법을 제시함.

(출처 : 요약문 4p)

Abstract ▼

The aim of this research project is to develop standard culture conditions and quality test methods that can be used clinically through the cultivation of human pluripotent stem cells without animal-derived components.

First, clinical level of human pluripotent stem cells were analyzed the ch

The aim of this research project is to develop standard culture conditions and quality test methods that can be used clinically through the cultivation of human pluripotent stem cells without animal-derived components.

First, clinical level of human pluripotent stem cells were analyzed the change of genome and SNP variation during long-term cultivation. we performed as follows.
1. We have obtained two human induced pluripotent stem cell lines (iPSC-NT4 and iPSC-CMC) that are clinically applicable and have a subculture of under 16 passages, and have been found to be optimal culture conditions for long-term culture condition (0, 15, 30 passages) using vitronectin and TeSR-E8 or Blew medium system among known xeno-free culture conditions.
2. As a result of SNP profiling and genomic alteration according to culture conditions and long-term cultivation, about 400,000 SNP mutations were identified in each cell line, and about 155-490 genetic variations also were observed.
3. After long-term culture, mRNA-Seq analysis was used to establishment a database of gene expression changes. During long-term passaging, iPSC-NT4 and iPSC-CMC slowed cell proliferation and increased spontaneous differentiation or did not attache on the culture dish.

Second, analysis of the SNP expression change database produced after the long term culture in the clinical grade and verification of pluripotent potential by differentiation induction of cultured human pluripotent stem cells
1. Identification of the signature of each cell line generated after the long-term culture, and analysis of the gene expression network related to the stem cell main function (differentiation of three germ layers, tumorigenicity, immune-rejection response related genes). The specific-markers also were confirmed.
2. The evaluation of stem cell pluripotency (mesoderm, hematopoietic progenitor, lung epithelial cell, vascular endothelial cell, neural progenitor cell) following long-term culture showed no significant difference in the pluripotent potential.
3. Early genome analysis showed a decrease in proliferation-related genes and an increase in the expression of metabolic genes during long-term culture. As a result, we have confirmed that the cells were going to receive a cell stress. Based on this, there is a need for a culture additive that can prevent cell damage caused by long-term culture. We propose the optimal long-term culture conditions and the quality test method of stress-reducing additive-treated human pluripotent stem cells.

(출처 : SUMMARY 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• 연구결과점검보고서 요약문 ... 4
• Summary ... 5
• 학술연구개발용역과제 연구결과 ... 7
• 제1장 최종 목표 ... 7
• 제2장 국내외 기술 현황 ... 14
• 제3장 최종 연구 내용 및 방법 ... 16
• 제4장 최종 연구 결과 ... 35
• 제5장 연구결과 고찰 및 결론 ... 90
• 제6장 연구성과 및 활용계획 ... 92
• 제7장 연구용역과제 진행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 95
• 제8장 기타 중요변경사항 ... 96
• 제9장 연구비 사용 내역(당해년도) 및 연구원 분담표 ... 97
• 제10장 참고문헌 ... 99
• 제11장 첨부서류 ... 102
• 끝페이지 ... 113