초록 ▼

MERS-CoV 중화 항체 개발을 위해, 인간 합성 Fab 파지디스플레이 라이브러리를 이용하여 MERS-CoV 의 Spike proteins S1과 S2 에 대한 패닝을 오송첨단의료산업진흥재단 신약개발지원센터에서 수립된 프로토콜에 따라 진행함. S1 과 S2 항원에 대한 패닝으로부터 얻은 파지를 이용하여 파지 ELISA를 수행한 결과 S1과 S2에 대하여 각각 30 종과 25종의 양성 Fab 항체 클론을 확보함. 얻어진 S1과 S2 양성 Fab 항체 클론들을 SARS-CoV와 다른 코로나바이러스의 spike protein에 대하여

MERS-CoV 중화 항체 개발을 위해, 인간 합성 Fab 파지디스플레이 라이브러리를 이용하여 MERS-CoV 의 Spike proteins S1과 S2 에 대한 패닝을 오송첨단의료산업진흥재단 신약개발지원센터에서 수립된 프로토콜에 따라 진행함. S1 과 S2 항원에 대한 패닝으로부터 얻은 파지를 이용하여 파지 ELISA를 수행한 결과 S1과 S2에 대하여 각각 30 종과 25종의 양성 Fab 항체 클론을 확보함. 얻어진 S1과 S2 양성 Fab 항체 클론들을 SARS-CoV와 다른 코로나바이러스의 spike protein에 대하여 파지 ELISA를 수행함으로서 교차반응성 여부를 확인한 결과 S1과 S2 Fab 항체 클론들 모두 음성의 ELISA 결과를 보임. 이것으로 볼 때 얻어진 항체들이 MERS-CoV에 매우 특이적인 것으로 판단됨. 30종의 S1과 25종의 S2 Fab 항체 클론들의 항체 유전자 서열을 분석한 결과 S1과 S2에 대하여 각각 6종과 3종의 unique Fab 항체 클론이 얻어짐. 선별된 6종의 S1, 3종의 S2 Fab 클론을 대장균 발현 벡터에 클로닝 하여 대장균에서 생산을 진행하고 affinity chromatography를 통해 Fab 항체를 정제한 다음, soluble ELISA를 통한 affinity 분석, PTS (protein thermal shift)를 통한 thermal stability (Tm) 및 size exclusion chromatography (SEC)를 통한 aggregation 분석을 진행하여 선별된 6종의 S1, 3종의 S2 Fab 클론의 특성분석을 비교 분석함. 선별된 6종의 S1, 3종의 S2 Fab 클론을 IgG 형태로 생산하기 위해 각 Fab 클론의 light chain (LC) 및 heavy chain (HC) 유전자를 각각 LC 및 HC 발현벡터로 클로닝하여 총 9종의 Fab 클론에 대한 IgG 발현벡터를 확보하였으며 HEK293 과 같은 mammalian cell에서 생산될 예정임.

(출처 : 요약문 4p)

Abstract ▼

In order to develop human monoclonal antibodies that are able to neutralize MERS-CoV, a human synthetic Fab phage display library has been panned against MERS-CoV spike proteins, S1 and S2, using a phage display panning protocol established by KBIOHealth-NDDC. To identify phage clones binding to S1

In order to develop human monoclonal antibodies that are able to neutralize MERS-CoV, a human synthetic Fab phage display library has been panned against MERS-CoV spike proteins, S1 and S2, using a phage display panning protocol established by KBIOHealth-NDDC. To identify phage clones binding to S1 and S2, monoclonal phage ELISAs were performed with phage clones obtained from the panning, revealing that 30 and 25 phage clones were shown to be positives for S1 and S2, respectively. To figure out whether the positive clones are able to crossreact with spike proteins from other corona virus including SARS-CoV, the positive phage clones were subjected to a phage ELISA using spike proteins from SARS-CoV and a corona virus as target antigens, showing that all of the positive clones did not crossreact with the other spike proteins tested. This indicates that the positive clones are highly specific to spike proteins of MERS-CoV. The 30 and 25 positive clones’DNA sequences were analyzed to reveal that 6 and 3 Fab clones were unique for S1 and S2, respectively. The 9 unique Fab clones were successfully cloned into an E.coli expression vector and subsequently expressed in E.coli followed by an affinity chromatography-mediated purification. The purified Fab antibody proteins were subjected to biophysical characterizations in terms of affinty, thermal stability, and aggregation through solubel ELISA, PTS (protein thermal shift), and size exclusion chromatography (SEC), respectively. Finally, the light chain (LC) and heavy chain (HC) genes from the 9 Fab clones were individually cloned into a LC and a HC expression vector which will be used for their production in mammalian cells such as HEK293.

(출처 : Summary 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 학술연구개발용역과제 연구결과점검보고서 ... 2
• 목차 ... 3
• 연구결과점검보고서 요약문 ... 4
• Summary ... 5
• 학술연구개발용역과제 연구결과 ... 6
• 제1장 최종 목표 ... 6
• 제2장 국내외 기술 현황 ... 8
• 제3장 최종 연구 내용 및 방법 ... 9
• 제4장 최종 연구 결과 ... 11
• 제5장 연구결과 고찰 및 결론 ... 21
• 제6장 연구성과 및 활용계획 ... 22
• 제7장 연구용역과제 진행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 24
• 제7장 기타 중요변경사항 ... 24
• 제9장 연구비 사용 내역(당해년도) 및 연구원 분담표 ... 25
• 제10장 참고문헌 ... 27
• 제11장 첨부서류 ... 28
• 끝페이지 ... 29