초록 ▼

○ 연구목표
메르스 및 인간 코로나바이러스에 대한 reverse genetic 시스템 개발: 국내에서 분리한 메르스 코로나바이러스에 대한 2종류의 전장 클론 확보(전장 cDNA를 지닌 BAC 클론 및 전장 PCR 산물)하고 이를 활용하여 항바이러스제 및 백신개발에 활용할 수 있는 형광단백질 리포터를 발현하는 재조합 메르스 코로나바이러스 개발. 아울러 대조군으로 사용할 수 있는 인간코로나바이러스(229E)에 대한 유사한 reverse genetics시스템 개발.

○ 연구내용
(1) 전장 메르스 바이러스 클론 확

○ 연구목표
메르스 및 인간 코로나바이러스에 대한 reverse genetic 시스템 개발: 국내에서 분리한 메르스 코로나바이러스에 대한 2종류의 전장 클론 확보(전장 cDNA를 지닌 BAC 클론 및 전장 PCR 산물)하고 이를 활용하여 항바이러스제 및 백신개발에 활용할 수 있는 형광단백질 리포터를 발현하는 재조합 메르스 코로나바이러스 개발. 아울러 대조군으로 사용할 수 있는 인간코로나바이러스(229E)에 대한 유사한 reverse genetics시스템 개발.

○ 연구내용
(1) 전장 메르스 바이러스 클론 확보
• 메르스바이러스 전장 클론 개발을 위한 벡터 및 프라이머 디자인
• 감염된 세포 혹은 배양액에서 추출한 핵산으로부터 바이러스의 전장 유전자를 증폭하여 하나의 클론으로 연결
(2) 전장 인간 코로나바이러스 클론 확보
• 감기코로나바이러스 229E 전장 클론 개발을 위한 벡터 및 프라이머 디자인
• 감염된 세포 혹은 배양액에서 추출한 핵산으로부터 바이러스의 전장 유전자를 증폭하여 하나의 클론으로 연결
(3) 형광단백질 발현 유전자 삽입 코로나바이러스 전장 클론 개발
• 전장 유전자가 클론된 벡터에 형광단백질 유전자 등 리포터 삽입
(4) 재조합 코로나 바이러스 생산
• 바이러스 복원(rescue) 조건 확립
• 재조합 바이러스 대량 생산

○ 연구결과 및 이에 따른 기대성과
(1) 한국 분리주 메르스 코로나바이러스에 대한 감염성을 가진 전장클론 및 형광 발현 유도체 클론 제작에 성공함(전장 cDNA 확보, 전장 cDNA를 안정한 벡터에 클로닝 서열분석/교정, 최종적으로 감염성을 검증한 2개의 전장클론 확보/제공)
(2) 한국분리주 복원 성공 및 기초특성 분석: 복원된 재조합바이러스의 복제 및 단백질 발현 확인
(3) 인간코로나바이러스(229E)에 대한 전장 PCR 산물(4개의 cDNA 조각으로 안정한 벡터에 클로닝 완료/서열분석/교정)을 확보. 이중 3개는 BAC 벡터에 삽입. 전장클론제작은 마지막 cDNA 삽입 시 불안정한 이유로 BAC 백터에 클론화가 불가하였음.
(4) 추가로 메르스 코로나바이러스 EMC주 전장에 대한 4개의 cDNA 조각을 제작하고 크로닝/서열분석/교정완료. BAC 벡터에 전장클론 제작은 4개 cDNA중 3개 삽입 후 마지막 cDNA 도입은 불안정화로 인해 클론화가 불가하였음.
(5) 제작된 전장 클론과 확보한 전장 cDNA들은 코로나바이러스 기초연구 및 제어기술개발에 유용한 실험재료로 활용이 기대됨. 나아가 신종/변종 코로나바이러스 출현에 대비할 수 있는 기반기술로 활용도가 높을 것으로 기대됨.

(출처 : 요약문 4p)

Abstract ▼

○ Research Purposes
Development of reverse genetic systems of MERS-CoV and hCoV: Establishment of full-length MERS-CoV clones for a Korean isolate (a BAC vector-based full-length clone and its derivative expressing a fluorescent reporter protein) and similar clones for human coronavirus (229E str

○ Research Purposes
Development of reverse genetic systems of MERS-CoV and hCoV: Establishment of full-length MERS-CoV clones for a Korean isolate (a BAC vector-based full-length clone and its derivative expressing a fluorescent reporter protein) and similar clones for human coronavirus (229E strain) that can be used as references.

○ Research Contents
(1) Construction of full-length MERS-CoV clones
• Designing vectors and primers for the development of full-length MERS-CoV clones
• Amplifying cDNA fragments from viral RNA extracted from either infected cells or virions, and ligation of cDNA fragments to construct a full-length clone.
(2) Construction of full-length hCoV/229E cDNA clones
• Designing vectors and primers for the development of full-length hCoV/229E clones
• Amplifying cDNA fragments from viral RNA extracted from either infected cells or virions, and ligation of cDNA fragments to construct a full-length clone.
(3) Development of full-length clone derivatives expressing a fluorescent reporter protein
• Insertion of the RFP reporter gene into the full-length clones established above.
(4) Propagation of recombinant coronaviruses from each clones
• Establishment of optimal rescue conditions for recombinant viruses
• Large scale propagation of recombinant viruses

○ Results and their impacts
(1) We have prepared cDNAs of two MERS-CoV isolates (a Koran isolate and the EMC strain) and the hCoV 229E strain. All cDNAs were cloned in vectors, analyzed by sequencing, and edited by site-directed mutagenesis (if required to edit undesirable mutations or to introduce cloning sites).

(2) We have generated an infectious cDNA clone of MERS-CoV Korean isolate and its derivative expressing a RFP reporter. Their infectivities have been verified following optimization of rescue conditions.

(3) Full-length cDNA clones for MERS-CoV EMC and hCoV 229E strains could not be generated due to clonal instability when particular cDNAs of these strains were attempted to be inserted into BAC vectors.

(4) The resulting infectious cDNA clones for the Korean isolate and cDNA clones for the EMC and 229E strains would be useful experimental reagents for coronavirus basic research and for the development of control measures against MERS-CoV or its variants that might be emerged in the future.

(출처 : Summary 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1학술연구개발용역과제 최종결과보고서 ... 2목차 ... 3연구결과최종보고서 요약문 ... 4Summary ... 5학술연구개발용역과제 연구결과 ... 6 제1장 최종 목표 ... 6 제2장 국내외 기술 현황 ... 14 제3장 최종 연구 내용 및 방법 ... 16 제4장 최종 연구 결과 ... 24 제5장 연구결과 고찰 및 결론 ... 64 제6장 연구성과 및 활용계획 ... 71 제7장 연구용역과제 진행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 73 제8장 기타 중요변경사항 ... 76 제9장 연구비 사용 내역(당해년도) 및 연구원 분담표 ... 77 제10장 참고문헌 ... 79 제11장 첨부서류 ... 81끝페이지 ... 95