[보고서]LBD 전사인자 패밀리의 식물발달 조절기능 및 네트워크 연구

김정묵

LBD 전사인자 패밀리의 식물발달 조절기능 및 네트워크 연구
Study on LBD transcription factor gene family and their transcriptional networks regulating plant development 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	전남대학교 Chonnam National University
연구책임자	김정묵
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2019-06
과제시작연도	2018
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
등록번호	TRKO201900021579
과제고유번호	1711071663
사업명	개인기초연구(과기정통부)(R&D)
DB 구축일자	2020-05-16
키워드	애기장대.전사인자.유전자발현조절.전사억제.옥신.앱식산.식물뿌리발달.화분발달.종자발아.

초록 ▼

□ 연구개요
본 과제의 연구목표는 식물호르몬 옥신 반응 측근형성, 식물호르몬 앱식산 (ABA) 반응 종자발아 저해, 수배우체발달 과정에서 식물 특이적 전산인자인 Lateral Organ Boundaries Domain (LBD) 패밀리 구성성분들이 조절하는 유전자 전사네트워크를 구축하고 그 조절과정의 분자기전을 규명하고, 식물과 환경과의 상호작용 및 조절기능을 분자 네트워크상에서 이해하고자 하였다. 이를 위하여 옥신 반응 LBD18 전사인자 조절 네트워크 연구, ABA 반응 LBD14, LBD37/38/39 전사인자 조절 네트워크 연구, 및 수배우체 발달 LBD10/27 전사인자 조절 네트워크 조사 및 LBD22/25/36의 화분발달과정에서의 세포학적 분석을 수행하였다.

□ 연구목표대비 연구결과
1. 식물호르몬 옥신 반응 측근형성에서 LBD18에 의한 ARF19 발현에 대한 feedback regulation mechanism을 연구하였다. 연구 결과 ARF7은 ARF19의 발현과 LBD18의 발현을 직, 간접적으로 조절하며, ARF19은 LBD18의 발현을 직접조절 한다. LBD18은 ARF19 프로모터 특정 부위에 결합하여 ARF19의 발현을 촉진시키고, ARF19 프로모터의 AuxRE 혹은 아마도 LBD18의 AuxRE에 결합한 ARF7에 단백질 결합하여 이의 전사활성을 촉진시킴으로써 positive feedback loop을 형성하는 것으로 보여진다. 2. 식물호르몬 ABA 반응에서 LBD14의 측근발달 단계별 주요 역할 및 LBD14 유전자 발현 조절이 ABA에 의한 측근발달 억제의 주요 인자로 작용하는지 조사하였다. LBD37/38/39의 ABA 반응에서의 생리학적 기능, LBD37/38/39 단백질 전사조절 기능, TPL/TPRs transcriptional corepressors 와의 상호결합 조사 및 EAR 억제 모티프의 역할 규명, ABA의 LBD37/38/39의 전사억제 기능 영향, ABA의 LBD37/38/39의 단백질 안정성 영향력, ABA와 ABA 수용체의 LBD37/38/39와 TPL 단백질 상호작용 제어기능 등을 조사하였다. 연구결과 LBD14는 측근의 원기 발달 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. LBD37, LBD38 및 LBD39 유전자가 종자발아를 억제하는 ABA 반응에서 음성적 조절인자로 작동하며 transcriptional corepressors로서의 분자기능을 보였다. 3. 수배우체 발달과정에서 LBD10 및 LBD27 하부조절 유전자 네트워크를 조사하기 위해 estradiol 처리에 따라 해당 형질전환체의 화분을 RNA-seq으로 분석하여 유전자 조절 네트워크를 조사하였다. 또한 LBD22/25/36의 화분발달과정에서의 세포학적 발현 분석 및 조직과 기관별 발현 특성, 단백질 상호작용 및 이에 따른 세포핵이송을 조사하였다. 연구결과 LBD22, LBD25, LBD36은 화분이외의 조직 외에 측근의 발달과정에서 기능할 가능성을 시사하였고 LBD22, LBD25, LBD36 단백질 안정성의 조절이 화분발달과정에서의 기능에 중요한 역할을 할 것으로 시사하였다. ProLBD10:LBD10:GR/XVE-LBD27 2중 형질전환식물체를 제작하여 chemical inducer 처리에 따른 LBD10과 LBD27의 발현 조절 시스템을 확립한 후 RNA-seq 방법으로 화분에서 LBD10/LBD27에 의해 조절되는 유전자들을 확보하여 생물 정보 분석을 완료하였다. 이후 유묘상태의 식물을 이용하여 LBD10 homodimer 및 LBD10/LBD27 heterodimer에 의해 조절되는 표적유전자들을 RNA-seq으로 분석 중이다.

□ 연구개발결과의 중요성
본 연구는 식물의 영양과 물의 흡수 및 토양 부착에 기능하여 식물의 생존과 환경스트레스 저항에 중요한 뿌리의 발달과정을 조절하는 전사인자들에 의한 유전자 조절 네트워크를 구축하고 조절 네트워크의 주요 작동원리 및 핵심 전사인자들을 발굴하였다. 식물의 생산성에 중요한 생식발달과정과 새로운 ABA 반응 조절 분자 기전의 일부를 규명하였다. 본 연구결과와 이의 후속 연구를 통하여 신재생 에너지 작물 및 경제성 농작물에 적용하여 바이오 연료 생산을 위한 바이오매스 증진과 농작물 수율 증진과 척박한 환경에서의 작물 생산이 가능한 유전자 조절 네트워크와 환경변화에 따른 네트워크 작동 원리의 개발을 도출 할 수 있을 것이다. 종국적으로 핵심 분자 알고리즘의 재설계에 의한 합성 네트워크의 구축과 네트워크 조절의 기반 지식으로 활용될 수 있을 것이다. 현대 생물학에서 가장 도전적인 과제중의 하나는 세포내에서의 복잡한 분자네트워크가 어떻게 정교한 조절기능을 수행하고 발달과정을 매개하는 것이다. 본 연구를 통하여 조절 네트워크의 설계원리의 일부를 확보할 수 있고 나아가 설계자 의도에 의한 비진화적 네트워크 원리를 이용한 합성 생물학도 가능할 것이다. 아울러 지구온난화의 진행과 석유에너지 자원의 고갈 및 인구팽창 등으로 인한 농작물의 부족 등의 문제 해결에 기여 할 수 있는 기본 분자네트워크 설계원리를 제공할 수 있다.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 7
가. 식물호르몬 옥신 반응 LBD18 전사인자 조절 네트워크 연구 ... 7
나. 식물호르몬 ABA 반응 LBD 전사인자 조절 네트워크 연구 ... 12
다. 수배우체 발달 LBD 전사인자 조절 네트워크 연구 ... 15
3. 연구개발결과의 중요성 ... 18
4. 참고문헌 ... 18
5. 연구성과 ... 19
대표적 연구실적 ... 21
끝페이지 ... 36

표/그림 (11)

표 LBD18 is a direct target of ARF19. (A) Expression of LBD18 in ProARF19:ARF19:GR plants. Seven-d-old Arabidopsis plants were treated with or without DEX at 10 μM and/or CHX for 2 h, and RNA from the roots dissected was subjected to RT-qPCR analysis. Relative fold changes were plotted after normalization to ACTIN7. Relative fold change represents the ratio relative to the transcript level of plants treated with mock. Mean ± SE values were determined from three biological replicates. Asterisks denote statistical signifiance at P < 0.05 (*) and P < 0.01 (**) by Student's t-test. (B) EMSA for 6xHis:SUMO:ARF19N using LBD18_AuxRE probe. EMSA was performed with increasing concentrations (50, 100, 200 and 400μM) of 6XHis:SUMO:ARF19N and 400 fmol of LBD18_AuxRE probe. 6xHis:SUMO was used as negative control for EMSA. FP, free probe. (C) Expression of ARF19 in ProLBD18:LBD18:SRDX/Col-0 and ProLBD18:LBD18:SRDX/lbd18 plants compared with that of Col-0 and lbd18. Seven-d-old plants were treated with or without IAA at 20 μM for 3 h and subjected to RT-qPCR analysis. Relative fold changes were plotted after normalization to ACTIN7. Relative fold change represents the ratio relative to the transcript level of plants at 0 time point. Mean ± SE values were determined from three biological replicates. Asterisks denote statistical signifiance at P < 0.01 (**) and P < 0.001 (***)
표 LBD18 binds a specific region of the ARF19 promoter in vitro. (A) Schematic diagram showing the oligonucleotide probes used for EMSA. Numbers shown below and above the line indicate the positions of nucleotides relative to the AUG initiation codon and the probe numbers, respectively. (B) Identification of the DNA region of the ARF19 promoter for LBD18 binding by using EMSA. EMSA was performed with 250 ng of 6XHis:SUMO:LBD18 and 400 fmol of the indicated DNA probes
표 LBD18 directly binds to a specific region of the ARF19 promoter for transactivation. (A) Identification of the minimal DNA region of the ARF19 promoter for LBD18 binding by using EMSA. Five nucleotides were serially deleted either from 5'- (d1-d4) or 3'-end (d5-d8) of probe #1. EMSA was performed with 500 ng of 6XHis:SUMO:LBD18 (aa#1-191) and 400 fmol of the indicated DNA probes. FP, free probe. (B) Determination of the nucleotides critical for LBD18 binding in the ARF19 promoter by using EMSA. The serial three bp mutations were made from 5' end in d3 probe, and EMSA was performed. (C) Mutation effects of the nucleotides identified as critical for LBD18 binding on transactivation in Arabidopsis protoplasts. The m2, m3, m4, or m5 mutations were generated in the 700 bp region of the ARF19 promoter [ProARF19(-700):LUC], and fused to LUC. Each of these LUC reporter constructs and Pro35S:Ω:LBD18 effector plasmids were cotransfected into mesophyll protoplasts isolated from Arabidopsis. LUC activities were normalized from GUS activities. Data are means ± SE of three independent biological experiments. Asterisks denote statistical signifiance at *P < 0.05 and ***P < 0.001
표 LBD18 enhances ARF7 transcriptional activity and competes out IAA repressors for ARF7. (A) Schematic showing effectors and reporters used in transient gene expression assays with Arabidopsis protoplasts. For reporter constructs, the ARF19 promoter region spanning -892 ~ -652 bps relative to the AUG initiation codon harboring two AuxREs (ProARF19(AuxRE):LUC) or mutated AuxREs (ProARF19m(AuxRE):LUC), or the DR5 promoter were fused to the 46 bp CaMV 35S minimal promoter and LUC. Effector constructs contained the ARF7 (A), LBD18 (B) and IAA14 (C) coding region under the control of the CaMV 35S promoter and a translational enhancer sequence (Ω) from tobacco mosaic virus located upstream of the translation initiation site. (B) and (C) Transient gene expression assays using ProARF19(AuxRE):LUC (B) or ProARF19m(AuxRE):LUC (C) reporters in Arabidopsis protoplasts with or without auxin. The Pro35S:GUS effector plasmid was co-transfected as internal control for normalizing transfection efficiency. Indicated reporter and effector constructs were transfected into mesophyll protoplasts prepared from Arabidopsis and incubated for 18 h. The protoplasts were then harvested, and the LUC and GUS activities were measured. Values on the y-axis arederived from measurements of relative light units of LUC activity after normalizing to GUS activity. The bars indicate SD of three independent experiments and different letters indicate a significant difference determined by one-way ANOVA with the Tukey’s honestly significant difference test (P<0.05). Number shown below the graph indicates the reporter construct shown in the left panel. (D) Effects of LBD18 and/or ARF19 overexpression on ProARF19(AuxRE):LUC or ProARF19m(AuxRE):LUC reporters. (E) Effects of LBD18 and/or ARF19 overexpression on ProARF19(AuxRE):LUC reporter. Transient gene expression assays were conducted and analyzed as described in Figure 9B
표 lbd Single, Double and Triple Mutants Exhibit Hyposensitive Response to ABA During Seed Germination. (A) Germination assays of wild-type and lbd37,38,39 single mutants. Seeds were sown on 0.5x MS agar plate containing a given concentration of ABA, stratified at 4캜 for 4 days, and then transferred to a growth room at 23캜 under 16-h photoperiod conditions. Germinated seeds were counted after given time points. The bars indicate SD of three independent biological replicates, and different letters indicate a significant difference determined by one-way ANOVA with the Tukey’s honestly significant difference test (P < 0.05). (B) Germination assays of wild-type, double and triple mutants. Germination assays were conducted as described in the Figure 3a. The bars indicate SD of three independent biological replicates, and different letters indicate a significant difference determined by one-way ANOVA with the Tukey’s honestly significant difference test (P < 0.05)
표 Complementation Lines of lbd Single Mutants Rescued the Hyposensitive Response of ABA Caused by lbd Mutants. (A) to (C) Germination assays of wild-type, lbd37 and ProLBD37:LBD37:10xMyc/lbd37 (A), lbd38 and ProLBD38:LBD38:10xMyc/lbd38 (B), and lbd39 and ProLBD39:LBD39:10xMyc/lbd39 lines. Germination assays were conducted as described in the Figure 3a. The bars indicate SD of three independent biological replicates, and different letters indicate a significant difference determined by one-way ANOVA with the Tukey’s honestly significant difference test (P < 0.05)
표 Transcription repression assays using the Gal4-LexA/UAS-LUCreporter system. The left panel shows schematic diagrams of the effector and reporter plasmids. The LexA(4X)-Gal4(3X):LUCreporter construct contains four copies of LexA binding sites (LexA BS) and three copies of Gal4-DNA binding sites (Gal4 BS) upstream of the CaMV 35S minimal promoter (35S MP). The Gal4-DNA binding domain (Gal4BD) was fused to LBD37, LBD38, or LBD39, and the LexA-DNA binding domain (LexABD) was fused to VP16. Gal4BD:IAA1 was used as a control for transcription repression. The given constructs were transfected into Arabidopsis mesophyll protoplasts, and the LUC and GUS activities were measured. In the right panel, values on the y-axis are derived from measurements of relative light units of LUC activity after normalizing to GUS activity. Mean ± SE values were determined from three biological and two technical replicates. Asterisks indicate significant differences using Student’s t test when comparing to Gal4BD (GD) (*P < 0.05 and ***P < 0.001)
표 GUS and GFP expression of ProLBD22:EGFP:GUS, ProLBD25:EGFP:GUS and ProLBD6:EGFP:GUS transgenic Arabidopsis plants. GUS expression of whole inflorescence (A, J and S), open flower (B, K and T), and mature pollen grains in dehiscent anthers (C, L and U) and GFP expression of mature pollen grains in dehiscent anthers (D, M and V). GFP expression in polarized microspore (E, N and W), early bicellular pollen (F, O, and X), mid-late bicellular pollen (G, P and Y), tricellular pollen (H, Q and Z), and mature pollen grain (I, R and Z’). Images in the upper and lower panels from E to I, N to Ror W to Z’ represent epifluorescence for GFP and DAPI-stained images, respectively. Scale bars : 10 μm
표 Analysis of LBD22, LBD25 and LBD36 expression. (A) Organ specific RT-PCR analysis. Total RNA was isolated from 7-day-old seedlings or 6-week-old wild-type Arabidopsis plants. RT, root; YS, young seedlings; CL, cauline leaves; RL, rosette leaves; ST, stem; FL, flowers. ACTIN7 was used as a loading control. (B-I) GUS expression of ProLBD22:EGFP:GUS (B and C), ProLBD25:EGFP:GUS (D, E and F) and ProLBD36:EGFP:GUS (G, H and I) transgenic Arabidopsis in lateral root (B, E and H), primary root (D and G), and young seedling (C, F and I)
표 Subcellular localization analysis of LBD22, LBD25 and LBD36 during Arabidopsis pollen development. Expression of LBD22:G3GFP in ProLBD22:LBD22:G3GFP (A-F), LBD25:G3GFP in ProLBD25:LBD25:G3GFP(G-L) and LBD36:G3GFP in ProLBD36:LBD36:G3GFP (M-R) transgenic Arabidopsis plants during pollen development. Early microspore with a central nucleus (A, G and M), polarized microspore (B, H and N), early bicellular pollen (C, I and O), mid-late bicellular pollen (D, J and P), tricellular pollen (E, K and Q), and mature pollen grain(F, L and R). Yellow and orange arrows indicate germ and sperm cell nuclei, respectively. White arrowhead indicates vegetative cell nucleus. Images in the upper and lower panels from A to F, G to L or M to R represent epifluorescence for GFP and DAPI, respectively. Scale bars: 10 μm
표 Subcellularlocalization analysis of LBD22, LBD25 and LBD36 during Arabidopsis pollen development. Expression of H2B:G3GFP in ProLBD22:H2B:G3GFP (A-F), ProLBD25:H2B:G3GFP (G-L) and ProLBD36:H2B:G3GFP (M-R) transgenic Arabidopsis plants during pollen development. Early microspore with a central nucleus (A, G and M), polarized microspore (B, H and N), early bicellular pollen (C, I and O), mid-late bicellular pollen (D, J and P), tricellular pollen (E, K and Q), and mature pollen grains (F, L and R). Yellow and orange arrows indicate germ and sperm cell nuclei, respectively. White arrowhead indicates vegetative cell nucleus. Images in the upper and lower panels for each transgenic Arabidopsis represent epifluorescence for GFP and DAPI, respectively. Scale bars: 10 μm

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