초록 ▼

연구개요
본 과제에서는 대장암세포에서 CD133이 5-FU 항암치료 내성에 미치는 역할을 규명하고 CD133 항체에 방사성 Zr-89을 표지하는 기술을 기초 조사함으로써 향후 치료용 방사성 Lu-177를 이용한 암치료기술 개발을 위한 기반 연구로 진행하였음. 본 과제를 1년만 진행한 이유는 대장암 세포에서 5-FU 항암제에 대한 치료내성에서 CD133이 담당하는 역할을 조사하고 방사성 Zr-89 표지 항체로 대장암세포의 CD133를 표적하는 기술을 정립하기 위함이었음. 그 결과를 토대로 후속연구에서 CD133를 표적하는 대장암

연구개요
본 과제에서는 대장암세포에서 CD133이 5-FU 항암치료 내성에 미치는 역할을 규명하고 CD133 항체에 방사성 Zr-89을 표지하는 기술을 기초 조사함으로써 향후 치료용 방사성 Lu-177를 이용한 암치료기술 개발을 위한 기반 연구로 진행하였음. 본 과제를 1년만 진행한 이유는 대장암 세포에서 5-FU 항암제에 대한 치료내성에서 CD133이 담당하는 역할을 조사하고 방사성 Zr-89 표지 항체로 대장암세포의 CD133를 표적하는 기술을 정립하기 위함이었음. 그 결과를 토대로 후속연구에서 CD133를 표적하는 대장암 방사면역치료 연구를 진행하고자 하였음.

연구 목표대비 연구결과
HCT116, HCT15, CT26, HT29 대장암세포 표면 CD133의 발현을 비교 확인함. 이러한 CD133가 5-FU 치료 내성을 보이는 대장암세포에 발현이 증가됨을 규명하였음. 나아가 CD133 발현은 세포주의 passage 수가 늘어날수록, confluence가 높을수록 많아졌음.
CD133 발현이 포도당 대사에 미치는 영향을 조사하여 magnetic assisted cell sorting (MACS) 기법으로 분리한 CD133을 발현하는 HCT116 대장암세포가 CD133을 발현하지 않은 암세포에 비해 높은 포도당 섭취가 확인되었음. 이는 항진된 lactate production을 동반하였고 oxygen consumption rate은 변화가 없었으므로 당대사가 glycolytic flux로 shift되는 Warburg effect가 항진된 소견이었음.
HCT116, CT26, HT29 대장암세포에서는 PI3K 및 AKT pathway가 CD133의 발현과 세포 생존에 미치는 영향을 조사한 결과 PI3K 신호를 억제하는 LY294002는 HCT116 암세포의 CD133 발현을 dose-dependent하게 억제시켰음. 아울러 LY294002는 모든 암세포의 생존을 억제시켰음. AKT 신호를 억제하는 MK2206은 모든 암세포의 생존을 억제시켰지만 CD133 발현에는 영향을 미치지 못하였음.
FACS 기법으로 분리한 CD133+/CD44+ HCT116 대장암세포와 CD133-/CD44- 암세포를 분리하였음.
이들 세포들을 에너지 대사를 표적하는 항암치료제들로 치료해 본 결과, 3-bromopyruvate, 2-deoxyglucose, perlongumin 모두 dose-dependent한 항암효과를 보였으나, 모든 약제에 대해 CD133+/CD44+ HCT116 대장암세포는 상대적으로 치료효과가 낮았음. 이 결과는 CD133 발현과 CD44 발현이 대장암 세포에 에너지 대사를 표적하는 항암치료에 대한 저항성에 기여함을 시사함.
5-FU 항암체의 치료효과와 CD133 발현에 미치는 영향을 조사하였음. 암세포의 생존을 sulfothodamine blue assay (SRB)로 분석한 결과 HCT116, HCT15 사람 대장암세포와 CT26, HT29 마우스 대장암세포에서 5-FU는 뚜렷한 항암효과를 보였음. 그러나 20% 내외의 암세포는 높은 5-FU 농도에도 불구하고 지속적으로 생존해 나가는 결과를 보였음. mTOR 억제제인 rapamycin로 치료하였더니 농도에 비례하여 CD133 발현이 강하게 증가하였지만 5-FU로 치료하였더니 CD133 발현이 오히려 감소함을 발견하였음. 이는 mTOR 경로가 CD133 발현을 억제시키고 있어 rapamycin로 이 경로를 차단하면 대장암세포의 CD133 발현 증가함을 의미함.
Phycoerythrin 형광으로 표지한 항-CD133 항체를 이용하여 FACS 분석 결과, A549 세포는 형광 염색된 세포가 매우 적었지만 HCT116 세포는 84% 이상이 형광 염색되었음. 이어서 영상에 이용 가능한 FITC와 Cy5.5 형광 표지 항-CD133 항체를 반응시킨 결과, HCT116 대장암세포는 프로브 농도에 비례하여 높은 섭취를 보였으며 A549 폐암세포에 비해 월등히 높았음.
HCT116 대장암세포 또는 A549 위암세포를 balb/c nude 마우스 어깨에 피하 주입하여 암 동물모델을 준비하였음. 합성한 F(ab')-Cy5 표지 CD133 항체절편 프로브를 정맥주사하고 광학영상을 촬영한 결과, CD133 발현이 낮은 A549 종양에 비해 CD133 발현이 높은 HCT116 대장암 종양에서 높은 섭취가 관찰됨. Ex vivo 촬영에서도 HCT116 종양에 높은 Cy5 표지 CD133 F(ab') 항체절편 섭취를 확인하였음. 이 결과와 같이 대장암세포 표면에 발현되는 CD133 바이오마커를 항-CD133 항체 프로브로 효과적으로 표적할 수 있었음.
합성에 성공한 Zr-89 표지 CD133 항체를 CT26 대장암 종양정상 면역 ICR 마우스와 면역결핍 Balb/C nude 마우스에 정맥주사하고 48, 120, 혹은 168 시간 뒤 암조직을 추출한 다음 체내분포를 조사하였음. 그 결과, 정상 면역 ICR 마우스에서 120 시간 뒤에 높은 tumor-to-blood ratio를 획득하였음.

연구개발결과 의 중요성
· 대장암에서 CD133 양성 암세포만이 종양 형성을 일으키며 고식적 치료의 내성에 깊이 관여하는 알려져 있으므로, 대장암의 치료내성 현상에서 CD133의 역할을 밝히고 암줄기세포와의 상관관계 정립은 새로운 개념의 대장암 치료기술 발전을 활성화시킬 수 있음.
· 대장암의 CD133를 표적하여 치료내성이 있는 암줄기세포를 제거하는데 방사면역치료가 유망한 전략이 되므로, Zr-89 방사성동위원소를 표지한 항체 프로브 제작에 대한 기초연구로 향후 종양 투과력과 방사능량을 높여 치료반응을 극대화시키는 기술 발전에 기여하게 됨.

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 3
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
• 2. 연구수행내용 및 연구결과 (총 연구기간, 1년) ... 5
• 각종 대장암 세포주에서 암줄기세포의 바이오마커인 CD133 발현율 확립 ... 5
• 대장암세포에서 CD133 발현이 포도당 대사에 미치는 영향 ... 5
• 대장암세포의 PI3 kinase 및 Akt 신호경로가 CD133 발현에 미치는 영향 ... 5
• CD133와 CD44 발현이 대장암세포의 에너지대사 표적치료 감수성에 미치는 영향 ... 6
• 대장암세포의 5-FU 치료에서 CD133과 치료내성 사이의 관계 규명 ... 6
• CD133 항체 기반의 형광 표지 프로브 합성에 성공함 ... 7
• 마우스 대장암세포 종양모델에서 CD133 발현과 rapamycin 치료의 영향 ... 7
• 항체에 Zr-89 방사성동위원소를 표지하는 기본 실험과 암세포 섭취 실험 ... 8
• 정상 및 면역결핍 대장암 동물모델에서 Zr-89 표지 항체의 체내동태 기초 조사 ... 8
• 3. 연구개발결과의 중요성 ... 9
• 4. 참고문헌 ... 9
• 5. 연구성과 ... 10
• 끝페이지 ... 11